桦褐孔菌多糖的乙酰化修饰及其抗氧化活性

邵珠领,吴艳丽,张 宇,*,王宇亮,赵 宏,赵芷萌

(1.黑龙江省新药创制与药效毒理评价重点实验室,佳木斯大学药学院,黑龙江佳木斯 154007; 2.生命科学与环境科学研究中心,哈尔滨商业大学,黑龙江哈尔滨 150070)

桦褐孔菌Inonotusobliquus(Fr.)Pilat属担子菌亚门层菌纲锈革孔菌目锈革菌科褐卧孔菌属[1]。桦褐孔菌主要分布在北半球北纬 40～50°的地区,如北美(北部)、芬兰、波兰、俄罗斯(西西伯利亚、远东部分地区、堪察加半岛)、日本北海道等国家和地区[2]。我国桦褐孔菌主要分布在吉林长白山地区、黑龙江大小兴安岭以及内蒙古等地[3]。桦褐孔菌具有降血糖、降血脂、免疫调节、抗肿瘤、抗辐射、抗氧化、抗寄生虫等多种药理活性,而其大部分生物活性与其中的多糖成分密切相关[4]。

多糖结构的化学修饰主要是利用多糖分子中的羟基、羧基、氨基等活性基团进行化学反应以引入新的基团,如硫酸基、磷酸基、羧甲基、烷基等[5]。多糖的乙酰化是一种重要的多糖修饰方法。乙酰基的引入使分子的伸展状态发生变化,导致多糖极性基团暴露,增加了多糖在水中的溶解性,同时乙酰基的数量和位置对多糖活性也有显著影响[6]。真菌多糖的生物活性与其结构密切相关,经化学修饰后,可能会提高多糖抗氧化、降血糖等作用[7-8]。杨春瑜等研究发现,对黑木耳多糖进行乙酰化修饰后,其抗氧化活性增加[9]。李淑琴等研究表明,乙酰化乌龙茶多糖溶解性增强,还原活性显著提高[10]。目前的文献对研究桦褐孔菌多糖的研究主要集中在提取分离等方面[11-12],关于其乙酰化修饰及其修饰后活性的研究还未见报道。

因此,本文以乙酸酐作为酰化试剂，对提取纯化后的桦褐孔菌多糖进行乙酰化修饰，并评价其抗氧化活性,为桦褐孔菌多糖抗氧化活性的构效关系研究和资源开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桦褐孔菌 购自黑龙江省佳木斯市亮子河山特产店；苯酚、氢氧化钠、浓盐酸、盐酸羟胺、三氯化铁、无水乙酸钠、三氯甲烷、正丁醇、浓硫酸、乙酸酐、无水乙醇 均为国产分析纯;葡萄糖、氯化乙酰胆碱 购自阿拉丁生化科技股份有限公司;透析袋Mw3000 购自源叶生物科技有限公司。

FDU-1200冷冻干燥机 日本东京理化;RE-2000A旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;DL-5-B 低速多管离心机 上海安亭科学仪器厂;765紫外可见分光光度计 上海仪电科学仪器股份有限公司;DBS100 自动馏分收集器 上海嘉鹏科技有限公司;Vortex-1/2 涡旋混合器 上海沪西分析仪器厂有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 桦褐孔菌多糖的提取 桦褐孔菌菌体粉碎后过80目筛,25 ℃条件下用95%乙醇浸泡1 d,减压过滤,滤饼(半径:7 cm,高:3 cm)50 ℃烘干24 h后备用。

取一定量烘干后的桦褐孔菌滤饼加入5倍体积的双蒸水95 ℃浸提3 h[11],过八层纱布保留滤液,滤渣重复提取一次,合并滤液,减压浓缩。浓缩液加入一定量的乙醇,使乙醇浓度达到80%,充分搅拌后放入4 ℃冰箱中醇沉12 h。25 ℃,4000 r/min离心10 min,收集沉淀,依次用无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤沉淀3次,130 Pa 45 ℃真空干燥12 h后得到桦褐孔菌粗多糖。按照以下公式来计算桦褐孔菌多糖的得率。

1.2.2 桦褐孔菌多糖的纯化 取真空干燥后的桦褐孔菌粗多糖适量,使用双蒸水配制成10%多糖溶液,按体积比1∶4加入Sevag试剂,充分振荡30 min后静置4 h。4000 r/min 25 ℃离心15 min,弃去下层蛋白,重复上述操作,紫外扫描检测,直至桦褐孔菌多糖溶液在260和280 nm波长处无明显紫外吸收,表示溶液中游离蛋白质类杂质已除尽。将脱蛋白后的多糖溶液55 ℃条件下减压浓缩至原溶液1/3后冷冻干燥,得到桦褐孔菌粗多糖。

取5 g脱蛋白的桦褐孔菌粗多糖溶于10 mL双蒸水中,4000 r/min 25 ℃离心15 min后,取上清液在已准备好的AB-8大孔树脂柱上进行上样。吸附24 h后用双蒸水进行洗脱,自动馏分收集器收集洗脱液,采用苯酚-硫酸法在490 nm波长(紫外可见分光光度计)隔管检测吸光度,合并洗脱液。洗脱液55 ℃条件下减压浓缩至原溶液1/3后透析(44 mm),冷冻干燥得到纯化后的桦褐孔菌纯化多糖。纯化后的桦褐孔菌多糖以D-葡萄糖为标准品,采用苯酚-硫酸法测定其总糖含量。

1.2.3 桦褐孔菌多糖的乙酰化修饰 取0.5 g桦褐孔菌纯化多糖溶于10 mL三蒸水中,用3%的氢氧化钠调节溶液pH至11.0。30 ℃油浴下,分别交替加入氢氧化钠溶液和乙酸酐各1 mL,控制反应溶液pH在7.0～11.0,直至加完乙酸酐。30 ℃条件下维持搅拌3 h(pH=8)。反应结束后,用1 mol/L盐酸中和反应溶液(pH=7),将反应液置于自来水中透析48 h,三蒸水中透析24 h。将透析液减压浓缩,冷冻干燥后得到乙酰化桦褐孔菌多糖[13]。另取两份相同量的桦褐孔菌纯化多糖,加入乙酸酐的量分别为2、3 mL,其余实验条件不变。

1.2.4 傅里叶红外光谱分析 取纯化桦褐孔菌多糖与加入1 mL乙酸酐乙酰化后得到的桦褐孔菌多糖各2 mg,采用溴化钾压片法,使用傅里叶红外光谱仪在400～4000 cm-1范围内进行光谱扫描。

1.2.5 乙酰基取代度的测定

1.2.5.1 标准曲线的绘制 用0.001 mol/L醋酸钠溶液将氯化乙酰胆碱标准品配制成浓度为1.064 mg/mL的溶液。精密移取氯化乙酰胆碱标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL置于试管中,加水至1 mL,加入2 mL碱性羟胺溶液,涡旋混合器混合均匀,于25 ℃放置4 min,加入1 mL 4 mol/L盐酸(pH为1.2±0.2),加入1 mL 0.37 mol/L三氯化铁-盐酸溶液,摇匀后在540 nm波长测定其吸光度。同步做上述各个标准系列溶液的空白对照,先加入盐酸后加入碱性羟胺,其余步骤与上述相同。

1.2.5.2 取代度测定 取桦褐孔菌多糖乙酰化溶液1 mL按照标准溶液的操作方法进行测定。根据标准曲线得到乙酰化桦褐孔菌多糖的乙酰基质量M1,按照以下公式计算出三个不同取代度的乙酰化桦褐孔菌多糖的取代度[14]。

乙酰基百分含量(W,%)=M1/M2×100

式中：M1-乙酰化桦褐孔菌多糖中乙酰基的质量(mg);M2-乙酰化桦褐孔菌多糖的质量(mg);162-葡萄糖相对分子质量;43-乙酰基相对分子质量;1-氢原子相对原子质量。

1.2.6 体外抗氧化活性研究

1.2.6.1 DPPH自由基清除率的测定 取3种不同取代度,不同浓度的桦褐孔菌乙酰化多糖及纯化后桦褐孔菌多糖样品溶液3 mL,加入新鲜配制的DPPH-乙醇溶液1 mL,涡旋混合器混合10秒,25 ℃水浴避光反应30 min,在517 nm处测定吸光度;以VC为阳性对照,同时测定空白组(样品不加DPPH)和阳性对照组样品吸光度。按如下公式计算对DPPH自由基清除率。

DPPH·清除率(%)=1-(A1-A2)/A0)×100

式中:A0-无样品溶液吸光度值；A1-样品溶液的吸光度值;A2-无DPPH样品溶液的吸光度值。

式中:A0-Tris-HCI溶液吸光值;A1-不加样品的Tris-HCI和邻苯三酚溶液的吸光度;A2-样品溶液的吸光度。

1.2.6.3 羟基自由基清除率的测定 在试管中依次加入不同浓度、不同取代度的三种乙酰化桦褐孔菌多糖及桦褐孔菌多糖样品溶液1 mL、0.75 mmol/L邻菲罗啉溶液1 mL、0.75 mmol/L硫酸亚铁1 mL、0.01%双氧水1 mL、0.15 mol/L磷酸盐缓冲液(pH=7.4)1.5 mL混匀,室温静置10 min,37 ℃加热1 h,在536 nm波长处测吸光度。蒸馏水和VC分别作为空白对照和阳性对照,按以下公式来计算羟自由基(·OH)的清除率(%)。

·OH清除率(%)=(A1-A0)/(A2-A0)×100

式中:A0-空白组样品溶液吸光值;A1-样品溶液吸光度值;A2-对照品溶液的吸光度(双氧水和样品溶液用蒸馏水来代替)。

1.3 数据分析

以上实验均平行进行3次,所得数据经SPSS 19.0 处理,使用Duncan’s检验分析显著性,p<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 桦褐孔菌多糖的制备及纯化

脱蛋白后的桦褐孔菌多糖使用蒸馏水配制成1 mg/mL溶液,紫外扫描后结果如图1所示,在260和280 nm处无明显紫外吸收,表明脱蛋白后的桦褐孔菌多糖已基本除去蛋白类杂质。考马斯亮蓝法测定脱蛋白后的桦褐孔菌多糖的蛋白含量为3.24%±1.23%。因为已经使用Sevag法除去蛋白类物质,检测到的可能是与多糖结合的蛋白类杂质。醇沉后的桦褐孔菌多糖,经真空冷冻干燥后,计算桦褐孔菌粗多糖提取率为13.2%。经AB-8纯化的洗脱曲线(图2),收集Fr.1部分,减压浓缩、冷冻干燥后得桦褐孔菌纯化多糖。

图1 桦褐孔菌多糖纯化处理后紫外扫描图谱Fig.1 The ultraviolet spectra of Inonotus obliquuspolysaccharides solution after purification

图2 桦褐孔菌多糖经AB-8纯化洗脱曲线Fig.2 Purification and elution curve of Inonotus obliquus polysaccharides by AB-8

2.2 桦褐孔菌多糖与乙酰化桦褐孔菌多糖的红外光谱分析结果

如图3所示,与桦褐孔菌多糖的IR图谱相比,乙酰化桦褐孔菌多糖在1713.66 cm-1波长处出现C=O双键伸缩振动峰,1230.41 cm-1波长处有酯基的C-O的伸缩振动,这表明样品的乙酰化是成功的[15]。乙酰化多糖在3400.00 cm-1左右的-OH吸收有所减弱,推测可能是因为部分糖链在修饰的过程中被水解。

图3 桦褐孔菌多糖(A)与乙酰化桦褐孔菌多糖(B)的红外谱图Fig.3 IR spectrum of Inonotus obliquus polysaccharides and acetylated Inonotus obolquus polysaccharides

2.3 乙酰化桦褐孔菌多糖取代度测定结果

氯化乙酰胆碱标准品乙酰基浓度与其吸光度标准曲线见图4。桦褐孔菌乙酰化修饰的乙酰基含量与取代度如表1所示,纯化后桦褐孔菌多糖中总糖含量为82.1%,不含乙酰基,经乙酰化修饰后,随着乙酰化试剂体积的增加,总糖含量减少,乙酰基含量增加,取代度也逐步提高。加入乙酸酐体积1、2、3 mL时,乙酰基含量分别为15.43、17.22、22.36 μg/mL;取代度分别为0.2810、0.3136、0.4072。

图4 氯化乙酰胆碱标准曲线Fig.4 The standard curve of acetylcholine chloride

表1 桦褐孔菌多糖乙酰化修饰的乙酰基含量与取代度Table 1 Acetyl content and substitution degree of acetylated modification of Inonotus obliquus polysaccharides

2.4 乙酰化修饰对桦褐孔菌多糖体外抗氧化活性的影响

2.4.1 DPPH自由基清除率变化 如图5所示,修饰后的桦褐孔菌多糖DPPH自由基清除率均随多糖质量浓度增加而增加,并且呈一定的剂量依赖关系。随着样品质量浓度的增加,可以观察到桦褐孔菌多糖和乙酰化桦褐孔菌多糖的清除率随着样品质量浓度的增加而增大。并且在质量浓度为5 mg/mL时,3种乙酰化程度不同的桦褐孔菌多糖DPPH清除率分别为71.5%、74.3%、75.4%,取代度越大,清除作用越强,显著高于桦褐孔菌多糖的清除率60.1%(p<0.05)。说明乙酰化修饰可以增强桦褐孔菌多糖清除DPPH自由基的能力。

图5 乙酰化桦褐孔菌多糖对DPPH自由基的清除作用Fig.5 DPPH radical scavenging activities of acetylated polysaccharide Ac-IOP注:VC:维生素C;IOP:桦褐孔菌多糖;Ac1-IOP:乙酰化桦褐孔菌多糖1;Ac2-IOP:乙酰化桦褐孔菌多糖2;Ac3-IOP:乙酰化桦褐孔菌多糖3；乙酰化桦褐孔菌多糖1～3的取代度分别为0.2810、0.3136、0.4072；图6～图7同。

2.4.2 超氧阴离子清除率变化 由图6可知,在所选的浓度范围内,桦褐孔菌多糖与乙酰化桦褐孔菌多糖对超氧阴离子的清除作用均随着样品质量浓度的增加而增强。不同取代度的乙酰化桦褐孔菌多糖在质量浓度为5 mg/mL时,分别达到的最大清除率为71.8%、74.9%、78.5%。随着取代度的增加,清除作用也随之增强。而桦褐孔菌多糖的最大清除率为61.8%。这表明,对桦褐孔菌多糖进行乙酰化修饰能显著提高其对超氧阴离子的清除作用(p<0.05)。

图6 乙酰化桦褐孔菌多糖对超氧阴离子自由基的清除作用 radical scavenging activities of acetylated polysaccharide Ac-IOP

2.4.3 羟基自由基清除率变化 图7结果表明,在0.5～5 mg/mL浓度范围内,随着多糖质量浓度的增加,桦褐孔菌多糖与乙酰化桦褐孔菌多糖对羟基自由基的清除作用增强,桦褐孔菌多糖与不同取代度的乙酰化桦褐孔菌多糖的最大清除率分别为61.5%和74.5%、79.9%、81.1%。说明羟基自由基清除率随着取代度的增加而增强。这表明对桦褐孔菌进行乙酰化修饰能够显著提高其羟基自由基清除能力(p<0.05)。

图7 乙酰化桦褐孔菌多糖对羟基自由基的清除作用Fig.7 ·OH- radical scavenging activities of acetylated polysaccharide Ac-IOP

乙酰化修饰是常用的一种分子修饰方法,结构修饰逐渐成为多糖构效关系的研究热点,乙酰化修饰可以改变多糖分子的定向性和横向次序,从而改变糖链的空间排布,改善其活性[16-17]。大量研究表明,乙酰化修饰可以增强多糖的抗凝血、抗肿瘤、免疫调节及抗氧化活性[18-19]。许多多糖在体外本身具有一定的抗氧化活性,经乙酰化修饰后的多糖其清除自由基的能力均有所增加,且还原能力也比原多糖有所提高[20]。实验表明,随着乙酰化程度的提高,乙酰化桦褐孔菌多糖的抗氧化活性均有所增强。Yang等人对龙眼果实的果皮中的多糖进行乙酰化修饰研究,发现其抗氧化活性与乙酰基取代度有关[21]。这与本次的实验结果是一致的。乙酰化桦褐孔菌多糖的抗氧化活性增强,可能是由于引入乙酰基后,使多糖支链得到伸展,导致多糖羟基暴露,向外伸展,从而有利于捕捉自由基，提高其抗氧化活性[22]。

3 结论

本实验在氢氧化钠的均相体系中,以不同体积的乙酸酐为酰化试剂对桦褐孔菌进行乙酰化修饰,调整反应液的pH在一定的范围内,获得3个取代度分别为0.2810、0.3136、0.4072的乙酰化桦褐孔菌多糖。进一步进行体外抗氧化实验表明，经乙酰化修饰后的桦褐孔菌多糖对DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基的清除率相对桦褐孔菌多糖都有一定的提高。乙酰化桦褐孔菌多糖的抗氧化活性与乙酰基取代度有关。本研究为桦褐孔菌多糖构效关系研究提供了新的研究方向,为桦褐孔菌的化学修饰提供了重要的参考。