高效液相色谱法测定阿萨伊冻干粉中矢车菊素3O葡萄糖苷的含量

王玉杰,李 伟,王林元,汤如莹,瞿 研,贺 成,张建军

(北京中医药大学,北京 100029)

阿萨伊(Açaí)为棕榈科植物阿萨伊棕榈树(EuterpeoleraceaeMart.)的果实[1],广泛分布于亚马逊流域的巴西、秘鲁、哥伦比亚等地。阿萨伊冻干粉是阿萨伊经挑选、清洗、去除果核、磨碎、冷冻干燥而制成[2]。其含有脂肪油(含量占50%以上)、甾醇、花青素、原花青素等物质[2-6]。花青素具有抗氧化、清除自由基、调节脂代谢、抗肿瘤等生物活性[7-11],其抗氧化能力比VE高50倍,比VC高20倍[7]。目前自然界已知的花青素有23种,在植物体中常见的有6种,最常见的为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷[12-14]。除蓝莓、桑葚等少数植物含量较高外,其他植物中含量普遍偏低,且由于其化学性质不稳定,高温易降解[15-18],难以富集和测定。目前,测定阿萨伊中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的文献较少,因此有必要对其进行研究。

矢车菊素-3-O-葡萄糖苷易溶于水和醇类溶剂,不溶于乙醚、二氯甲烷等有机溶剂,遇热不稳定。其结构母核是由两个苯环通过中间三碳链相互连接而成C6-C3-C6结构,并与1个葡萄糖通过糖苷键结合形成花青素苷。矢车菊素-3-O-葡萄糖苷在中性或弱酸性(pH4～7)条件下,呈中性醌式碱,显紫色;在强酸条件(pH1～3)下,呈烊阳离子形式存在,显红色[19-22],见图1。矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对照品为盐酸盐,分子式C21H21ClO11,分子量484.84;矢车菊素-3-O-葡萄糖苷分子式为C21H21O11,分子量449.38,故矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量=矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(盐酸盐)含量/1.079。

图1 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷在不同pH溶液中的构型Fig.1 Conformations of cyanidin-3-O-glucoside in different pH solutions

测定阿萨伊中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的文献较少,且缺少HPLC-紫外检测器的测定方法。采用HPLC-MS法测定的有如下文献,Garzón等人采用0.01%盐酸甲醇提取阿萨伊鲜果,测得矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量为0.57 mg/g[23];Schauss A G等人采用丙酮-水-乙酸溶液(70∶29.5∶0.5)提取阿萨伊冻干粉,测得矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量为1.17 mg/g[24]。另有采用HPLC-紫外检测器测定黑豆皮和紫背天葵中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的含量的文献[25-26]。本实验研究采用HPLC-紫外检测器,分别以水和1%盐酸水溶液为溶剂,使矢车菊素-3-O-葡萄糖苷分别呈中性醌式碱构型(pH4～7)和烊阳离子构型(pH1～3)构型,探讨构型对矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量测定的影响,建立了阿萨伊冻干粉中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的含量测定方法。2013年卫生部批准阿萨伊作为新资源食品使用[27],目前,国内已有阿萨伊与淡竹叶、雪莲等中药配伍的市售产品,本文对阿萨伊的质量控制进行研究可以为相关产品的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(盐酸盐),分子式C21H21ClO11,分子量484.84 上海诗丹德生物技术有限公司,批号:7084-24-4,质量分数≥98%;阿萨伊冻干粉 蒙维(上海)贸易有限公司,批号:20170228、20170307、20170315;乙腈 色谱纯,Fisher公司;超纯水 实验室自制;磷酸、盐酸 分析纯,北京化工厂。

Agilent 1100型高效液相色谱仪 美国安捷伦公司；G1311A四元梯度泵、G1322A在线脱气机、G1316A柱温箱、G1315D DAD检测器、手动进样器和化学工作站 杭州赛析科技有限公司;UV-2450型紫外分光光度计 日本岛津公司;Model 9860A/D型超声波清洗机 天津科贝尔光电技术有限公司;BT 1250D电子天平 Sartorious公司。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件的考察

1.2.1.1 两种构型对最大吸收波长的影响 精密称取矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对照品,分别以水和1%盐酸水溶液为溶剂配制对照品溶液,使其分别呈中性醌式碱和烊阳离子构型,浓度约为0.01 mg/mL,以分光光度计在190～800 nm范围进行全波长扫描,考察矢车菊素-3-O-葡萄糖苷两种构型对最大吸收波长的影响。

1.2.1.2 两种构型对测定波长和色谱峰分离度的影响 精密称取矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对照品,分别以水和1%盐酸水溶液为溶剂配制对照品溶液,使其分别成中性醌式碱和烊阳离子构型,浓度约为0.01 mg/mL。

取阿萨伊冻干粉约0.6 g,精密称定,用滤纸包裹,各加入石油醚50 mL,超声脱脂0.5 h,取出,挥去石油醚,精密加入水10 mL,称重,超声提取1 h,冷却至室温,补足减失的重量,过滤,取续滤液作为中性醌式碱构型的阿萨伊冻干粉供试品溶液。

取阿萨伊冻干粉约0.6 g,精密称定,置于锥形瓶中,精密加入1%盐酸水溶液10 mL,称重,超声提取1 h,冷却至室温,补足减失的重量,过滤,取续滤液作为烊阳离子构型的阿萨伊冻干粉供试品溶液。

色谱条件:色谱柱为DIKMA C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);流动相组成为乙腈-0.5%磷酸溶液(12∶88),流速1 mL/min[28],分别于最大吸收波长270、520 nm测定。以色谱图中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷色谱峰分离和基线噪音为指标,考察两种构型对矢车菊素-3-O-葡萄糖苷测定波长和色谱峰分离度的影响。

1.2.2 供试品溶液制备方法的考察

1.2.2.1 两种构型对脱脂阿萨伊冻干粉中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷提取的影响 阿萨伊冻干粉含有50%以上的脂肪油,取阿萨伊冻干粉约0.6 g,精密称定,用滤纸包裹,各加入石油醚50 mL,超声脱脂0.5 h,取出,挥去石油醚,分别精密加入80%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、水、1%盐酸水溶液各10 mL,称重,超声提取1 h,冷却至室温,补足减失的重量,作为供试品溶液。矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对照品分别用与供试品相同溶剂溶解,使呈相同构型,浓度约为0.01 mg/mL。按照“1.2.1.2”项下色谱条件测定,考察两种构型对脱脂阿萨伊提取矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的影响。

1.2.2.2 两种构型对未脱脂阿萨伊冻干粉中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷提取的影响 取阿萨伊冻干粉约0.6 g,分别精密加入80%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、水、1%盐酸水溶液各10 mL,称重,超声提取1 h,冷却至室温,补足减失的重量,作为供试品溶液。矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对照品分别以供试品相同溶剂溶解,使呈相同构型,浓度约为0.01 mg/mL。按照“1.2.1.2”项下色谱条件测定,考察两种构型对未脱脂阿萨伊提取矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的影响。

1.2.3 两种构型对紫外检测器响应因子和标准曲线的影响 精密称取矢车菊素-3-O-葡萄糖苷,加水1 mL溶解,再分别以水和1%盐酸水溶液为溶剂稀释,使其分别呈中性醌式碱和烊阳离子构型;制成每1 mL含矢车菊素-3-O-葡萄糖苷为0.002419、0.004838、0.009676、0.01935、0.03871、0.07741 mg/mL的对照品溶液,按照“1.2.1.2”项下色谱条件测定两种构型矢车菊素-3-O-葡萄糖苷不同浓度的峰面积、响应因子(仪器对单位浓度样品的响应值)和标准曲线,考察两种构型对紫外检测器的响应因子和标准曲线的影响。

1.2.4 两种构型对含量测定结果的影响 采用中性醌式碱构型测定:取阿萨伊冻干粉约0.6 g,精密称定,用滤纸包裹,各加入石油醚50 mL,超声0.5 h,取出,挥去石油醚,再精密加入水10 mL,称重,超声提取1 h,冷却至室温,补足减失的重量,过滤,取续滤液作为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷中性醌式碱构型的供试品溶液。另取矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对照品,加水溶解,浓度约为0.01 mg/mL,作为对照品溶液。

采用烊阳离子构型测定:取阿萨伊冻干粉约0.6 g,精密称定,置于锥形瓶中,精密加入1%盐酸水溶液10 mL,称重,超声提取1 h,冷却至室温,补足减失的重量,过滤,取续滤液作为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷烊阳离子构型的供试品溶液。另取矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对照品,加1%盐酸水溶液溶解,浓度约为0.01 mg/mL,作为对照品溶液。

按照“1.2.1.2”项下色谱条件测定,考察两种构型对矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量测定结果的影响。

1.2.5 方法学考察

1.2.5.1 线性实验 精密称取对照品2.61 mg,加1%盐酸水溶液制成矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量分别为0.002419、0.004838、0.009676、0.01935、0.03871、0.07741 mg/mL的供试品溶液。上机,用液相色谱仪测定峰面积,以峰面积为纵坐标,以浓度为横坐标,绘制标准曲线。

1.2.5.2 精密度实验 精密称取阿萨伊冻干粉约0.6 g,精密加入1%盐酸水溶液10 mL超声提取1 h,滤液作为供试品溶液,连续进样6次,记录矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的峰面积。

1.2.5.3 稳定性实验 取“1.2.5.2”项下供试品溶液,分别于室温放置0、6、12、24、48、72 h后,上机,用液相色谱仪测定峰面积。

1.2.5.4 重复性实验 取同一批次阿萨伊冻干粉6份,制备供试品溶液,按照方法测定含量。

1.2.5.5 加样回收实验 取同一批次阿萨伊冻干粉(含量为0.1233 mg/g)9份,每份0.3 g,精密称定,分别加入矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对照品溶液50、75、100 μL(每1 mL相当于矢车菊素-3-O-葡萄糖苷0.4839 mg),各加入量平行操作3份,制备供试品溶液,按照方法测定含量。

1.2.6 样品测定方法 取3批次阿萨伊冻干粉,按照确定的方法测定矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量。每批次平行测定3组。

1.3 数据处理

2 结果和分析

2.1 色谱条件的考察

2.1.1 两种构型对最大吸收波长的影响 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷中性醌式碱和烊阳离子构型的紫外-可见吸收光谱见图2。由图2可知,矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对照品溶液的中性醌式碱和烊阳离子构型对最大吸收波长无影响,分别在270、520 nm波长有强吸收。

图2 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的紫外吸收光谱图Fig.2 UV absorption spectra of cyanidin-3-O-glucoside

2.1.2 两种构型对测定波长和色谱峰分离度的影响 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷两种构型在270、520 nm的色谱图,见图3、图4。结果表明,以乙腈-0.5%磷酸溶液(12∶88)为流动相,矢车菊素-3-O-葡萄糖苷两种构型对色谱峰分离无影响。两种构型供试品色谱图在270 nm波长基线噪音大,无法准确测定,在520 nm波长基线稳定,因此选择520 nm作为测定波长。

图3 对照品和样品的高效液相色谱图(270 nm)Fig.3 HPLC chromatogram of reference substances and sample(270 nm)

图4 对照品和样品的高效液相色谱图(520 nm)Fig.4 HPLC chromatogram of reference substances and sample(520 nm)

图4 两种构型矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的标准曲线Fig.4 Standard curve for the two form of cyanidin-3-O-glucoside

2.2 供试品溶液制备方法的考察

2.2.1 两种构型对脱脂阿萨伊提取矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的影响 对脱脂阿萨伊冻干粉分别以多种溶剂提取,测定矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的含量,结果见表1。脱脂后多种溶剂提取,测定为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的含量基本一致。结果表明,两种构型对脱脂后阿萨伊冻干粉中提取矢车菊素-3-O-葡萄糖苷无影响。

表1 阿萨伊冻干粉脱脂后经不同溶剂提取矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量的测定结果Table 1 Determination results of cypermethrin-3-O-glucoside content in Açaí freeze-dried powder extracted by different solvents after degreasing

2.2.2 两种构型对未脱脂阿萨伊提取矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的影响 对未脱脂阿萨伊冻干粉分别以多种溶剂提取,测定矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的含量,结果见表2。由表2可知,矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量测定结果不一致。以1%盐酸为溶剂制成的失车菊素-3-O-葡萄糖苷烊阳离子构型含量测定结果最高,并与“2.2.1两种构型对脱脂阿萨伊提取矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的影响”项下脱脂阿萨伊冻干粉测定结果相同,表明失车菊素-3-O-葡萄糖苷呈烊阳离子构型,易溶于水,可不脱脂提取,简化操作。

表2 未脱脂阿萨伊冻干粉经多种溶剂提取后矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量的测定结果Table 2 Determination results of cypermethrin-3-O-glucoside content in undefatted Açaí freeze-dried powder extracted by different solvents

2.3 两种构型对紫外检测器的响应因子和标准曲线的影响

配制不同浓度矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对照品中性醌式碱和烊阳离子构型的对照品溶液,测定峰面积,计算响应因子和标准曲线,烊阳离子构型的标准曲线为y=37029.5438x-7.6051,R2=0.9999。中性醌式碱构型的标准曲线为y=8100.2724x-1.0906,R2=1.0000,结果见表3和图5。结果表明,两个构型均呈良好线性关系。但是,烊阳离子构型时响应因子是中性醌式碱构型的4.6倍,导致标准曲线斜率不同,表明烊阳离子构型构型影响紫外吸收强度,使响应因子增大,有利于准确测定矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量。

表3 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷两种构型的峰面积和响应因子Table 3 Peak area and response factor for the two forms of cyanidin-3-O-glucoside

2.4 两种构型对含量测定结果的影响

分别采用矢车菊素-3-O-葡萄糖苷中性醌式碱和烊阳离子构型,测定阿萨伊冻干粉中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量,结果见表4。分别以中性醌式碱和烊阳离子构型测定矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的含量一致,但相同浓度的供试品和对照品峰面积不一致。结果表明,两种构型对含量测定结果无影响。测定方法中对照品和供试品制备溶剂应一致,使其呈相同构型,否则会导致测定结果有误。

表4 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷中性醌式碱和烊阳离子构型含量测定结果Table 4 Results of determination for the two forms of neutral quinonoidal anhydrobase and flavylium cation of cyanidin-3-O-glucoside

2.5 方法学考察结果

2.5.1 线性实验 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷在0.002419～0.077412 mg/mL范围呈线性关系,标准曲线方程为:y=37029.5438x-7.6051,R2=0.9999。

2.5.2 精密度实验 连续进样6次,矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的峰面积RSD%为0.92%,结果表明仪器精密度良好。

2.5.3 稳定性实验 分别于室温放置0、6、12、24、48、72 h后,峰面积RSD%为1.14%,结果表明,供试品溶液室温下放置72 h内稳定性良好。

2.5.4 重复性实验 6份同一批次阿萨伊冻干粉中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量为0.1233 mg/g,RSD%为1.82%,结果表明该方法重复性良好。

2.5.5 加样回收实验 9份同一批次阿萨伊冻干粉(含量为0.1233 mg/g),平均回收率为98.31%,RSD%为1.44%。结果表明,该方法回收率良好。结果见表5。

表5 回收率实验结果 Table 5 Results of recovery rate experiment

2.6 阿萨伊冻干粉样品中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量测定结果

取3批次阿萨伊冻干粉中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量测定结果见表6。由表6可知,3批次阿萨伊冻干粉中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量为0.1158～0.1663 mg/g。

表6 阿萨伊冻干粉中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量测定结果Table 6 Determination results of cypermethrin-3-O-glucoside content in Açaí freeze-dried powder

3 结论

本研究发现,以1%盐酸水溶液为溶剂,使阿萨伊冻干粉中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷呈烊阳离子构型,易溶于水,可不脱脂提取,简化操作;以HPLC-紫外检测器测定矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量,采用两种构型测定矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量的结果无差异,但选择烊阳离子构型,因其响应因子大于中性醌式碱,有利于准确测定;并提示,测定方法中对照品和供试品溶液中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷构型应保持一致,否则会因响应因子不同而导致测定结果产生误差。矢车菊素-3-O-葡萄糖苷烊阳离子构型在0.002419～0.077412 mg/mL范围呈线性关系,y=37029.5438x-7.6051(R2=0.9999),回收率为98.31%(RSD%=1.44%),3批阿萨伊冻干粉中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的含量为0.1158～0.1663 mg/g。本研究建立的方法简便、灵敏、测定结果准确、重复性好,对阿萨伊相关产品的质量控制有一定的参考价值。