拳参总黄酮体外抑菌作用的初步研究*

王桂玲 费洪荣 赵雪梅 赵 莹

山东第一医科大学(山东省医科院)，山东 泰安 271016

拳参为蓼科蓼属植物拳参(Polygonum bistorta L.)的根茎, 别名紫参、山虾、草河车等，主要分布在吉林、河北、山东、湖北、陕西等地。苦、涩，性寒，具有清热解毒、止血、消肿等功效，用于治疗赤痢、热泻、肺热咳嗽、痈肿、痔疮出血、蛇虫咬伤等。拳参根茎中含有多种化学成分如：黄酮类，萜类、醌类、多糖、粘液质、树脂等。近年来有许多文献报道了蓼科蓼属植物在抗肿瘤、抗氧化、止痛、抗菌、抗炎等方面的应用[1-4]。本研究是以拳参中总黄酮作为研究对象，研究其对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑制效果，并测定最低抑菌浓度(MIC)。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

RE-52A旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；MPZ1002电子天平(上海恒平科学仪器有限公司)；FDU-1200冷冻干燥机(上海爱朗仪器有限公司)；岛津UV-2500紫外-可见分光光度计(岛津国际贸易(上海)有限公司)；TMQ.R-3250自动台式灭菌器(山东新华医疗器械股份有限公司)；KQ-500DE 数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；SW-CJ-2F超净工作台(苏州净化设备有限公司)；HHB11电热恒温培养箱(天津市实验仪器厂)

1.2 材料和试剂

拳参(济南药业集团中药饮片厂)；芦丁标准品(天津一方科技有限公司)；HPD-400型大孔吸附树脂(河北沧州宝恩化工有限公司)；菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌(泰山医学院形态学实验室提供)；DMSO(分析纯)(天津市凯通化学试剂有限公司)；其它试剂均为分析纯。

2 实验方法

2.1 溶液配制

2.1.1标准品溶液的制备 精密称取芦丁标准品1 mg，甲醇溶解，定容至10 ml容量瓶中，配成质量浓度为0.1 mg/ml的芦丁标准品溶液，保存，备用。

2.1.2AlCl3溶液的制备 称取AlCl325 g，甲醇溶解，定容至250 ml容量瓶中，配成10%AlCl3溶液，保存，备用。

2.1.3样品的制备 准确称取拳参40 g，按最佳工艺条件[5]提取，10倍量55%乙醇回流提取3次，每次1 h，合并提取液，回收乙醇，水溶液部分用石油醚萃取2次，萃取后的溶液分成2份，一份溶液采用冷冻干燥，制成粗粉，即粗品。另外一份溶液用浓盐酸调节pH为3的上柱液，然后以流速1 ml·min-1上预处理的HPD-400型大孔吸附树脂柱，吸附完全后，先以蒸馏水洗脱至无色，再用55%乙醇洗脱[6]，收集洗脱液，回收乙醇，水溶液部分进行冷冻干燥，制成粗粉，即精品。

2.2含量测定

2.2.1确定最大吸收波长 精密吸取“2.1.1”项芦丁标准品溶液0.5 ml，置于10 ml比色管中，加甲醇至1 ml，再加10%的AlCl3溶液2 ml，摇匀，放置10 min，在紫外分光光度仪上200～600 nm区间扫描，确定最大吸收波长为415 nm。

2.2.2标准曲线的制备 精密吸取“2.1.1”项芦丁标准品溶液0 ml、0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml,分别置于10 ml比色管中，各加甲醇至1 ml，再分别加入10%的AlCl3溶液2 ml，摇匀，放置10 min，在415 nm波长处测定吸光度，平行测定3次求平均值，以质量浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线，经线性回归，得回归方程：A=13.656C+0.0404，R2=0.9969，表明在0.02～0.1 mg/ml线性关系良好。

2.2.3样品含量的测定 准确称取拳参总黄酮粗品及精品各10 mg，甲醇定容至10 ml容量瓶中，分别用移液管移取1 ml，置10ml比色管中，各加入10%的AlCl3溶液2 ml，摇匀，放置10 min，在415 nm波长处测定吸光度，代入“2.2.2”项标准曲线，计算黄酮的含量。

3 抑菌实验

3.1 菌悬液的制备

在洁净工作台上，将供试菌株(金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、大肠杆菌Escherichia coli)接入试管斜面培养基上。然后置于(35±1)℃的恒温培养箱内培养 18～24 h，将供试菌株活化，然后用灭菌的生理盐水配制浓度为107～108cfu·ml-1的菌悬液，备用。

3.2 药敏片的制备

取定性滤纸，用打孔机打成6 mm直径的圆形小纸片，将滤纸片放入清洁干燥的培养皿中，高压消毒灭菌后，备用。

3.3 总黄酮粗品及精品溶液的制备

分别称取拳参总黄酮粗品及精品适量，各置于1.5 mlEP管中，各加入1 mlDMSO，超声溶解，整个操作过程严格无菌。

3.4 总黄酮粗品及精品的抑菌活性测定

采用Kirby-Baue纸片扩散法：在无菌洁净工作台上，用涂抹法将各供试菌液接种在培养基上，制成含菌平板。用无菌镊子夹取滤纸片浸泡在总黄酮粗品及精品及DMSO溶液中，然后夹取滤纸片放入培养皿中，置于37 ℃恒温培养箱内培养24 h，空白对照为DMSO，观察纸片周围有无抑菌圈，并测量抑菌圈的直径，以抑菌圈直径d大小进行判断(d>6 mm表示有抑菌作用；d≤6 mm表示无抑菌作用；mm6

表1 拳参总黄酮粗品及精品对供试菌的抑菌圈直径

由表1可以看出，拳参总黄酮的粗品及精品对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都有一定的抑制作用，根据抑菌圈直径判断，总黄酮精品对两种菌抑制作用明显，属于高度敏感，总黄酮粗品对两种菌抑制作用属于中度敏感。

表2 拳参总黄酮精品对供试菌的最低抑菌浓度

由表2可以看出，拳参总黄酮精品对两种菌都有较强的抑制作用，MIC 值分别为：金黄色葡萄球菌为0.08257 mg/ml，大肠杆菌为0.08257 mg/ml。

3.5 总黄酮粗品及精品最低抑菌浓度(MIC)测定

称取拳参总黄酮粗品及精品溶液按二倍稀释法稀释成各种浓度，方法为各取灭菌EP管14支，各按照1至14编号。首先向管中各加入500 μl的DMSO，加500 μl的药液于第1管中，混匀，从1号管中吸取500 μl溶液放入2号管，混匀，接着从2号管中吸取500 μl溶液放入3号管，依次逐管稀释到第13管，第14管加入DMSO做空白对照。用无菌镊子夹取滤纸片在各管溶液中进行浸泡，然后夹取滤纸片放入已接种菌液的培养皿中，DMSO为空白对照，放于37 ℃恒温培养箱内培养24 h，观察纸片周围有无抑菌圈，并测量抑菌圈的直径。以能抑制细菌生长的最低浓度为拳参总黄酮对该细菌的最低抑菌浓度(MIC)。结果如表2、3，图1～4所示。

表3 拳参总黄酮粗品对供试菌的最低抑菌浓度

由表3可以看出，拳参总黄酮粗品对2种菌也有一定的抑制作用，MIC值分别为：金黄色葡萄球菌为0.2815 mg/ml，大肠杆菌为0.2815 mg/ml。

图1 拳参总黄酮精品抑制金黄色葡萄球菌效果照片 图2 拳参总黄酮精品抑制大肠杆菌的效果照片

图3 拳参总黄酮粗品抑制金黄色葡萄球菌的效果照片 图4 拳参总黄酮粗品抑制大肠杆菌的效果照片

抑菌实验研究表明，拳参总黄酮粗品及精品对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有一定的抑制作用。拳参作为常用的中草药，在我国分布广泛，资源丰富，且含有多种活性成分，其含有的成分具有毒副作用小，不易产生耐药性的特点，实验结果表明拳参总黄酮在抗菌方面具有广泛的应用潜力，有良好的应用前景。本研究为拳参药理作用的进一步开发提供了实验依据，同时也为拳参资源进一步开发和利用提供了参考。