基于美拉德反应的低温化学标记法

涂桂飞，罗惠，陈莹莹，胡蕾琪，栾东磊*

1(上海海洋大学，食品热加工工程技术中心，上海，201306) 2(上海海洋大学 食品学院，上海，201306)

随着现代社会人们生活节奏的加快，便捷食品受到了广大消费者的青睐，而家用微波炉因加热速度快、热效率高等优点被广泛应用于需二次加热的便捷食品中[1]。但是微波炉内的电场分布差异导致了加热不均匀的问题[2-3]，为了研究微波对便捷食品加热的均匀性，急需找到一种有效方式来确定微波加热后整体温度分布。传统研究中只能利用红外热像仪观察食品表面温度，或利用热电偶测量内部有限个数的温度值，而无法得到完整的温度分布，基于美拉德反应的化学标记法被用以分析微波热处理后食品的温度分布[4-7]，其原理是还原糖和氨基酸反应生成棕色物质。温度越高，加热时间越长，含该类反应底物的模拟食品颜色越深，因此微波加热后可通过颜色的深浅程度获得热形及冷热点。此前PANDIT等[8]使用土豆泥确定微波高温灭菌(121 ℃)过程中食品的冷点位置；BORNAORET等[4,7]探究了90 ℃条件下结冷胶、土豆泥、蛋白凝胶的颜色变化规律，建立了颜色值与灭菌时间的关系，为微波巴氏杀菌奠定了基础；ZHANG等[9-11]利用结冷胶、蛋白凝胶分析微波巴氏杀菌的温度分布。以上研究表明化学标记法在微波加热食品的温度分布研究中起到了重要作用，但是这些研究均为微波杀菌中的应用，其反应在较高温度下进行，而在微波对便捷食品加热均匀性研究中，便捷食品复热的目标温度通常为65～70 ℃[12]，因此分析其内部温度分布需要低温化学标记法的支持。

本研究以D-核糖和L-赖氨酸为主要原料进行美拉德反应，首先研究了溶液中影响反应速率的因素，获得最优的反应速率条件，将其应用于作为化学标记法载体的模拟食品，并探究其在不同温度下的显色反应。最后对模拟食品进行微波加热，分析其显色效果，以期为微波低温复热便捷食品的研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

结冷胶，美国唐瑞斯食品物料公司；D-核糖、L-赖氨酸，北京百灵威科技有限公司；NaOH、HCl、CaCl2、FeCl3等，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

B11-2型恒温磁力搅拌器，上海司乐仪器有限公司；25UG26威力微波炉，中山东菱威力电器有限公司；HH-6数显恒温水浴锅，金坛市城西富威实验仪器厂；3nh-ys3060分光测色仪，深圳市三恩时科技有限公司；FE 20实验室pH计，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；Jumbo 35真空包装机，verbeelen Smart way酒店用品商贸有限公司；TA.XT Plus型物性质构仪，英国Stable Micro System公司；Thermo Evolution 201型紫外、可见光分光光度计，赛默飞世尔科技公司；PICOVACQ/1TC型无线温度传感器，安联国际有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1D-核糖和L-赖氨酸体系模型反应

已有文献表明，当pH<7时，美拉德反应不明显[13]，因此本试验只探究碱性条件下pH对核糖-赖氨酸反应体系的影响。参照文献[14]中的方法。称取1 g核糖和1 g赖氨酸加入98 g水中，制备6份备用，分别调节溶液pH值至7、8、9、10、11、12，并分别在55、65、75℃水浴下加热20 min，然后放入冰水中冷却，冷却后使用紫外、可见光分光光度计在200～800 nm测量吸光度。

称取1 g核糖和1 g赖氨酸加入98 g水中，调节溶液pH值至12，将pH=12的核糖-赖氨酸溶液分别在55、65、75℃水浴下反应10、20、30、40、50、60 min，冷却后使用紫外、可见光分光光度计在200～800 nm测量吸光度。

配制0.002、0.004、0.006、0.008 mmol/L的FeCl3溶液，称取1 g核糖、1 g赖氨酸和10 g FeCl3溶液加入88 g水中(1%质量分数组)，称取2 g核糖、2 g赖氨酸和10 g FeCl3溶液加入86 g水中(2%质量分数组)，调节溶液pH值至12，在55℃水浴下反应20 min， 冷却后使用紫外、可见光分光光度计在200～800 nm测量吸光度。

1.3.2 模拟食品结冷胶凝胶的制备

根据已有研究[4-8]，为了消除透明对颜色测量时的影响，本实验加入牛奶使透明的模拟食品结冷胶变成乳白色。具体操作步骤如下：将质量分数为1%的结冷胶粉溶于水中，加热至90℃左右，加入一定量的CaCl2，至CaCl2溶解，30 s后停止加热，待溶液温度降低，加入一定量的核糖、赖氨酸和牛奶，搅拌均匀，根据需求调节溶液pH，倒入容器中，冷却形成模拟食品结冷胶凝胶。

1.3.3 模拟食品结冷胶凝胶颜色的测定

按照1.3.2的方法制备饼形(直径×高度，85 mm×4 mm)模拟食品备用，将模拟食品放入包装袋中抽真空处理，加热后放入冰水中冷却。将分光测色仪通过黑板、白板校正，使用分光测色仪测量不同加热时间下的凝胶与未加热凝胶的L、a、b值，其中L表示亮暗；a表示红绿；b表示黄蓝，测量3次取平均值，得到色差ΔE[15]如公式(1)所示。

(1)

1.3.4 模拟食品结冷胶凝胶持水能力的测定

按照1.3.2的方法制备结冷胶凝胶，倒入30 mL针管中，待凝结后，将样品推出，并切成底面直径24 mm、 高度10 mm的圆柱形。参照文献[16]的方法，把样品加入离心管中，探究不同含量的CaCl2对结冷胶凝胶持水能力的影响，测定条件为2 000 r/min，离心10 min，每种配比的样品重复试验3次。结果取平均值，根据公式(2)计算持水能力。

(2)

式中:m0是空离心管的质量；m1是离心前凝胶和离心管的总质量；m2是离心后除去水分凝胶和离心管的总质量。

1.3.5 模拟食品结冷胶凝胶强度的测定

制作底面直径40 mm、高度25 mm的圆柱形凝胶，参照文献[17]的方法，探头选择P0.5，以1 mm/s的速度移动使凝胶载体达到40%的形变，其中触发力为5 g，凝胶强度用曲线上的最大值表示。每种配比的样品重复试验5次，结果取平均值。

1.4 数据分析

采用Excel 2010软件和SPSS 19.0对数据进行统计处理和显著性分析，当P<0.05时认为差异显著。

2 结果与分析

2.1 pH值与温度对D-核糖和L-赖氨酸反应体系的影响

图1-A～图1-C为55、65、75 ℃下，不同pH值的D-核糖和L-赖氨酸溶液加热20 min时的紫外可见光吸收光谱图，图1-D为在55、65、75℃下，308 nm处吸光度随pH值变化曲线。由图1-A～图1-C可知，热处理后D-核糖和L-赖氨酸溶液的最大吸收峰集中在308 nm附近，说明生成产物主要为中、小分子[18-19]。由图1-D可知，当反应体系的pH值为7～9时，吸光度较低且变化缓慢，此时D-核糖和L-赖氨酸反应不明显；当pH值>9时，D-核糖和L-赖氨酸溶液吸光度值上升较快，在pH值=12时达到最大值，这说明随着pH值的增加，D-核糖和L-赖氨酸的反应速率逐渐增加且在pH值为12时达到最大值。这与吴惠玲等[13]研究的pH对葡萄糖-赖氨酸体系的结果和AJANDOUZ等[20]研究的pH对果糖-赖氨酸体系的结果类似，原因是在碱性条件下，由于邻近N原子的影响，糖碱基C1上电子密度增大，经2,3-烯醇化反应，经过脱氨后生成还原酮类和二羰基化合物。由于还原酮类化学性质活泼，可进一步脱水再与胺类缩合，或者还原酮类本身发生裂解成形较小分子，如二乙酰、乙酸、丙酮醛等，因此，碱性环境有利于美拉德反应的进行。由吸光度随pH值变化曲线可得，在55 ℃ 下pH=12的吸光度是pH=7时吸光度的24倍，65 ℃下pH=12的吸光度是pH=7时的140倍，75 ℃ 下pH=12的吸光度是pH=7时的190倍，随着温度的升高，pH值对反应促进效果得到放大，说明二者具有协同作用。

A、B、C-55、65、75 ℃下不同pH的溶液加热20 min的紫外可见光吸收光谱图；D-308 nm处吸光度随pH值变化曲线图1 pH值与温度对D-核糖和L-赖氨酸反应体系的影响Fig.1 Effect of pH and temperature on the reaction system of D-ribose and L-lysine

2.2 温度与时间对D-核糖和L-赖氨酸反应体系的影响

图2-A～图2-C为pH=12的D-核糖和L-赖氨酸溶液，在55、65、75 ℃下加热不同时间的紫外可见光吸收光谱图，图2-D为pH=12的D-核糖和L-赖氨酸溶液在308 nm处加热不同时间的吸光度。由图2-A～图2-C可知，D-核糖和L-赖氨酸反应体系分别加热10、20、30、40、50、60 min后的最大吸收峰都集中在308 nm附近，而随着加热时间的增加，308 nm处的吸光度逐渐增加，说明核糖和赖氨酸反应产物逐渐增多。由图2-D可得，在75 ℃下加热10 min的吸光度相当于在65 ℃下加热30 min的吸光度，超出了在55 ℃ 下加热60 min的吸光度，这说明温度是加快核糖-赖氨酸体系反应的重要因素，与郑晓杰等[21]研究的温度对鸡骨酶解液美拉德反应的影响一致。而随着加热时间的增加，75与55 ℃、65与55 ℃、75与65 ℃ 的吸光度倍率差值逐渐减小，这是由于初始加热时，温度较高的反应速率较快，生成产物较多，而反应底物的量是一定的，随着热处理时间的增加，不同温度之间产物量的差距减小。因此，要使含有D-核糖和L-赖氨酸的模拟食品在低温下较快显色需从其他方面考虑。

2.3 Fe3+与反应底物浓度对D-核糖和L-赖氨酸反应体系的影响

由于本实验要使模拟食品在低温下较快显色，因此在研究了温度、加热时间、pH值外，还分析了底物浓度和金属Fe3+对反应体系的影响。图3为pH=12的D-核糖和L-赖氨酸溶液在55 ℃下加热20 min后，不同Fe3+浓度和底物浓度对吸光度的影响。由图3-A可知，随着Fe3+浓度的升高，1%(质量分数)核糖和1%(质量分数)赖氨酸组和2%(质量分数)核糖和2%(质量分数)赖氨酸组在308 nm处的吸光度先增加后降低，在0.004 mmol/L时达到最大值。这说明Fe3+可以影响D-核糖和L-赖氨酸的反应速率，随着Fe3+浓度的提高，两者反应速率出现先增加后降低的趋势，最适浓度出现在0.004 mmol/L。由图3-B可知，热处理条件相同时，溶液(pH=12)含有2%核糖、2%赖氨酸、0.004 mmol/LFe3+反应速度最快，这是由于增加反应底物浓度、添加0.004 mmol/L的Fe3+都能加快美拉德反应速率。这与吴惠玲等[13]关于金属Fe3+能促进美拉德反应和BORNHORET等[7]关于增加反应底物浓度能促进美拉德反应的研究结果类似，原因可能是Fe3+通过形成络合物来促进薛夫碱(Schiff)的形成，从而加快了D-核糖和L-赖氨酸的反应速率。随着反应物浓度的提高，反应物与反应物之间分子发生碰撞的几率增高，所以反应速率加快。

A、B、C-55、65、75 ℃下pH=12的溶液加热不同时间的紫外可见光吸收光谱图；D-308nm处吸光度随加热时间变化曲线图2 温度与时间对D-核糖和L-赖氨酸反应体系的影响Fig.2 Effect of temperature and time on the reaction system of D-ribose and L-lysine

A-308 nm处不同底物浓度溶液的吸光度随Fe3+浓度的变化曲线；B-不同Fe3+和底物浓度的溶液紫外可见光吸收光谱图图3 Fe3+浓度与反应底物浓度对D-核糖和L-赖氨酸反应体系的影响Fig.3 Effect of Fe3+ Concentration and substrate concentration on D-Ribose and L-Lysine reaction system

2.4 CaCl2质量分数对模拟食品结冷胶持水能力、凝胶强度的影响

已有研究表明，结冷胶的凝胶强度和持水能力越大，越能保证样品形状稳定[4-5]。将含有结冷胶粉的溶液制作成凝胶固体时，CaCl2浓度对其成型影响较大，因此考察了不同CaCl2含量对凝胶的影响。图4-A和图4-B为当胶粉含量为1%(质量分数)时，不同CaCl2含量对结冷胶持水能力和凝胶强度的影响。

A-凝胶强度随CaCl2含量的变化曲线；B-持水能力随CaCl2含量的变化曲线图4 不同CaCl2含量对模拟食品结冷胶凝胶强度和持水能力的影响Fig.4 Effect of different content of calcium chloride on gel strength and water holding capacity of model food gel

由图4可知，随着CaCl2含量的增加，结冷胶的持水能力和凝胶强度呈先增加后降低。当CaCl2含量为0.07%(质量分数)时，结冷胶的持水能力和凝胶强度最大，分别为96%和3 146 g。这与HUANG等[22]研究的结冷胶凝胶性质随金属离子变化趋势和邵瑶瑶等[23]研究的蛋白凝胶随金属离子变化趋势类似，原因是结冷胶分子的羧基侧链在静电作用下出现互相排斥，这阻碍了螺旋的紧密聚集，而阳离子的介入能屏蔽静电排斥作用，一个阳离子连接一对羧基，因此当加入Ca2+时，结冷胶的持水能力、凝胶强度也随之提高；但过多的阳离子又会阻碍结冷胶双螺旋结构的有序聚集，减弱凝胶，所以当离子浓度超过一定限度，又会造成结冷胶持水能力、凝胶强度下降[24]。因此本实验使用0.07%(质量分数)CaCl2来制作结冷胶凝胶，满足对结冷胶凝胶进行切片处理以分析整体温度分布的需求。

2.5 结冷胶的颜色变化

将制作模拟食品溶液的pH调为12并添加0.004 mmol/L Fe3+(实验组)与不对制作模拟食品的溶液处理(对照组)加热不同时间进行对比，由图5可知，pH=9的组别(对照组)在不同温度下加热不同时间后，结冷胶颜色由白色变为黄色，pH=12的组别(实验组)则由淡黄色变为黄红色，并随着加热时间的增加，结冷胶颜色最终变为黑红色，与对照组相比，实验组美拉德反应程度更深。

图5 模拟食品结冷胶颜色随时间变化图Fig.5 Chart of colour change of model food gel with time

图6为不同组别模拟食品的色差随加热时间的变化规律。由图6可知，随着加热时间的增加，结冷胶的色差ΔE逐渐增大，这是由于反应产物逐步增多，这与项惠丹等[25]研究的酪蛋白与还原糖反应和王博等[26]研究的酪蛋白酸钠与还原糖类反应一致。在pH=9的组别(对照组)中，相同热处理时间下，温度越高，色差ΔE越大，说明升高温度能加快D-核糖和L-赖氨酸的反应速率，这与液体体系中得到的结论相符。

图6 结冷胶的色差ΔE随加热时间的变化规律Fig.6 Variation of ΔEvalue of model food gel with heating time

当溶液(pH=12)含有1%D-核糖、1%(质量分数)L-赖氨酸、0.004 mmol/L Fe3+时，制成的结冷胶在55 ℃下加热10 min的色差相当于65 ℃1%组加热50 min的色差以及75 ℃1%组加热30 min的色差，说明将制作溶液pH调至12、添加Fe3+制成的模拟食品颜色变化速度极大加快，在pH=12含有Fe3+的反应体系中，2%组结冷胶色差显著高于1%组色差(P<0.05)，因此当溶液(pH=12)含有2%D-核糖、2%L-赖氨酸、0.004 mmol/L Fe3+时，制成的结冷胶颜色变化最快。

2.6 模拟食品结冷胶在微波热处理下实验验证

将由2%D-核糖、2%L-赖氨酸、0.004 mmol/L Fe3+、pH=12的溶液制成的模拟食品结冷胶(直径×高度：14 cm×2 cm)放入700 W微波炉中加热90 s，得到加热后模拟食品的温度分布及冷热点，准备一个相同的样品，在已知冷热点位置分别插入2个无线温度传感器如图7-A所示，其中一个温度传感器探头插入热点位置a，另一个探头插入冷点位置b，放入微波炉内相同位置加热90 s，将加热后的中部切面图经MATLAB软件处理转换成伪彩图，增强图片颜色对比度来更清晰地显示热形；图7-B为90 s内冷热点的温度曲线，热点位置a在加热后由12 ℃升至59 ℃，并变为暗黑色，美拉德反应程度较高，而冷点位置b由12 ℃升至39 ℃，仍为淡黄色，美拉德反应程度低。便捷食品复热的目标温度通常为65～70 ℃，而本实验中结冷胶能在微波炉内90 s加热到60 ℃左右显色，因此在微波对便捷食品加热均匀性研究中，可以使用该模拟食品分析其内部温度分布。

A-温度分布图; B-冷热点分布图图7 微波热处理后温度分布图及冷热点温度曲线Fig.7 Temperature distribution after microwave heating and cold hot spot temperature curve

3 结论

在D-核糖和L-赖氨酸液体反应体系中，生成产物的吸收峰集中在308 nm附近，当pH值在7～12时，美拉德的反应速率随着pH的升高而增加；随着温度的升高，pH值对反应促进效果被温度放大，说明二者具有协同作用；此外，Fe3+也可以影响D-核糖和L-赖氨酸的反应速率，随着Fe3+浓度的升高，两者反应速率出现先增加后降低的趋势，最适浓度为0.004 mmol/L。在制作模拟食品结冷胶时，当胶粉含量为1%(质量分数)、CaCl2含量为0.07%(质量分数)时，制作的结冷胶凝胶强度和持水能力最高，凝胶质地坚硬，能在加热后切片进行热形分析；在相同热处理条件下，当溶液(pH=12)含有2%D-核糖、2%L-赖氨酸、0.004 mmol/L Fe3+时，制成的结冷胶颜色变化速度最快，在微波炉中加热90 s由12至60 ℃左右能显色，因此在微波对便捷食品加热均匀性研究中，可以使用该模拟食品分析其整体温度分布，本试验为微波低温复热便捷食品的研究提供了一定的基础。