电感耦合等离子体质谱法分析海蟹中的砷元素分布特征

严 国，梅光明*，常家琪，张小军，顾 捷，孟春英

（1.浙江海洋大学食品与医药学院，浙江 舟山 316021；2.浙江省海洋水产研究所，浙江 舟山 316021；3.浙江省海水增养殖重点实验室，浙江 舟山 316021）

砷（As）是自然界中广泛分布的一种重要的类金属元素，可与肌体细胞中的酶结合，使许多酶失活，造成代谢障碍[1]。自然界中的砷元素通常由地表径流等方式进入海水中，又通过食物链在海产品富集，因此海产品摄入成为人体暴露砷元素的主要途径之一[2-3]。海产品中的砷分为无机砷和有机砷两大类，其中无机砷主要指砷酸根（arsenate，As（V））和亚砷酸根（arsenite，As（III）），有机砷主要指一甲基砷（monomethyl arsenic acid，MMA）、二甲基砷（dimethyl arsenic acid，DMA）、砷甜菜碱（arsenobetaine，AsB）、砷胆碱（arsenocholine，AsC）、砷糖和砷脂等[4]。砷的生物毒性不仅与其总含量相关，更大程度上与其存在的形态种类相关[5]，以半致死量（LD50）计，毒性依次为As（III）＞As（V）＞MMA＞DMA＞AsB＞AsC[6-7]。无机砷是砷元素化合物致畸、致癌及致突变的主要来源，有机砷通常被认为是低毒或者无毒的，海产品中砷化合物的含量较高，但主要以无毒或低毒的AsB和砷糖的形式存在[4]。

目前砷形态分析的方法主要有高效液相色谱-原子荧光光谱（high performance liquid chromatography-atomic fluorescence spectrometry，HPLC-AFS）法[8-10]、高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱（high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry，HPLC-ICP-MS）法[11-14]以及毛细管电泳-ICP-MS法[15-17]等。HPLC-ICP-MS因结合了HPLC的高效分离性能和ICP-MS的超强元素分析能力，具有线性范围宽、检出限低、灵敏度高且干扰少等优点，已成为目前砷形态分析最有力的方法，广泛应用于食品[3,14,18-19]、药品[20-21]、环境[22-23]中砷化合物的测定。GB 5009.11—2014《食品中总砷及无机砷的测定》[24]中第一法HPLC-AFS法最多只能测定As（III）、As（V）、MMA和DMA这4 种砷形态分析物，不能测定AsB等（因其无法转化成含砷的气态氢化物而被AFS测定）。该标准中的第二法使用HPLC-ICP-MS测定了5 种砷形态，但在实际样品中也很难将AsB和DMA分开，严重影响二者定性和定量准确性要求。海蟹因具有味道鲜美、低脂肪、高蛋白等优点，深受消费者喜爱，但同时作为一种营养级别较高的甲壳类海产生物，其富集砷元素能力较强，已有文献中有关不同品种海蟹及蟹体不同组织中砷元素的分布特征的研究报道较少。本实验运用优化后的ICP-MS法对4 种海蟹（青蟹、三疣梭子蟹、日本鲟和细点圆趾蟹）及其不同组织（蟹肌肉、蟹钳肉、蟹鳃、肝胰腺和性腺）中的砷元素分布特征进行测定，为海蟹砷污染风险评估及消费者食用建议提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青蟹、三疣梭子蟹、日本鲟和细点圆趾蟹均购于浙江省舟山市超市或集贸市场，按照GB/T 30891—2014《水产品抽样规范》[25]处理后作为待测样品。

AsB溶液标准物质（GBW 08670）、MMA溶液标准物质（GBW 08668）、DMA溶液标准物质（GBW 08669）、As（V）溶液标准物质（GBW 08667）、As（III）溶液标准物质（GBW 08666） 中国计量科学研究院；砷单元素标准溶液（1 000 μg/mL，GSB04-1714-2004） 国家有色金属及电子材料分析测试中心；扇贝粉（GBW10023）和紫菜粉（GBW10050）生物成分分析标准物质 地球物理地球化学勘查研究所；金枪鱼组织中砷形态标准物质（BCR-627） 欧洲标准局。

(NH4)2CO3、NH4H2PO4、(NH4)2HPO4（均为色谱纯）德国Sigma公司；甲醇、正己烷（均为色谱纯） 德国Merck公司；硝酸（优级纯） 美国J.T.Baker公司；过氧化氢、氨水（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；质谱调谐液（10 μg/L Ce、Co、Li、Tl、Y）、内标液（100 μg/mL Bi、Ge、In、Li、Lu、Rh）美国Agilent公司；实验用水为Milli-Q制备超纯水（电阻率≥18.2 MΩ·cm）。

1.2 仪器与设备

AcquityTMH-class超高效液相色谱仪 美国Waters公司；7900型ICP-MS仪 美国Agilent公司；Centrifuge 5810高速离心机 德国Eppendorf公司；MS2旋涡混合器德国IK公司；AL204型电子天平 瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司；超声清洗机 宁波海曙科生超声设备有限公司；pH计 德国Sartorius公司；ETHOS 1型微波消解仪 意大利Milestone公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

砷形态物标准储备溶液：将5 种不同形态砷（AsB、MMA、DMA、As（III）、As（V））的标准物质溶液取适量分别准确转移至5 mL容量瓶中，用超纯水分别定容至5 mL，其质量浓度分别为14.72、9.54、22.17、28.78、6.88 μg/mL，于4 ℃避光保存，备用。

砷形态物混合标准使用液：分别准确移取5 种不同形态砷（AsB、MMA、DMA、As（III）、As（V））的标准储备溶液340、524、226、174、727 μL于5 mL容量瓶中，用超纯水容至5 mL，使各组分质量浓度均为1.0 μg/mL，现用现配。

砷形态标准曲线系列：分别准确移取砷形态物混合标准使用溶液50、100、250、500 μL用流动相定容至5 mL，使标准溶液质量浓度为10、20、50、100 μg/L，现用现配。

砷单元素标准曲线系列溶液：将1 000 μg/L砷单元素标准溶液用1%硝酸溶液逐级稀释到1.0、5.0、10.0、30.0、50.0、100.0、300 μg/L，超纯水定容至5 mL备用。

硝酸溶液（0.15 mol/L）：准确量取10 mL硝酸，溶于水并稀释至1 000 mL。

(NH4)2CO3溶液（50 mmol/L）：称取2.450 3 g（精确至0.000 1 g）(NH4)2CO3，溶于500 mL水中，用氨水调节pH 9.5，经0.45 μm水相滤膜过滤后超声脱气30 min，备用。

1.3.2 样品前处理

1.3.2.1 总砷测定前处理

准确称量0.5 g（精确至0.000 1 g）均质后的待测螃蟹样品于聚四氟乙烯消解罐中，依次加入6.0 mL硝酸、2.0 mL过氧化氢溶液，摇匀后加盖放置过夜，使样品进行预消解。次日将消解罐放入微波消解系统中，设置适宜的微波消解程序（表1），按照相关消解步骤进行消解。消解完毕后，180 ℃于赶酸架上加热赶酸至1～2 mL，冷却至室温后用超纯水定容至50 mL，采用ICP-MS上机测定。同时做试剂空白实验，采用扇贝粉和紫菜粉作为质控样进行结果质量控制。

表1 微波消解程序Table 1 Microwave digestion procedure

1.3.2.2 砷形态前处理

准确称量均质后的待测样品0.5～1.0 g（精确至0.000 1 g）于50 mL离心管中，加入20 mL 0.15 mol/L硝酸溶液，3 000 r/min涡旋1 min，置于气浴恒温振荡器中，在50 ℃、150 r/min过夜振荡提取，提取完毕后次日取出，冷却至室温，3 000 r/min涡旋30 s，6 000 r/min离心8 min。移取5 mL上清液于15 mL离心管中，加入正己烷3 mL，3 000 r/min涡旋1 min后再6 000 r/min离心8 min，弃去正己烷层。吸取下层清液，经0.22 μm水相滤膜过滤后上HPLC-ICP-MS分析。按相同操作方法做试剂空白实验，同时检测BCR-627标准物质进行结果质量控制。

1.3.3 方法

1.3.3.1 总砷含量测定

表2 ICP-MS工作参数Table 2 Working parameters of ICP-MS

使用1.0 μg/L Ce、Co、Li、Tl、Y的调谐液在线优化ICP-MS各项参数，使分辨率和灵敏度等各项仪器性能达到最佳。总砷含量测定时采用1.0 μg/mL89Y溶液在线加入内标，用于校正仪器响应信号强度的变化。优化后ICPMS的主要参数见表2。将砷元素标准曲线系列溶液从低浓度到高浓度依次于ICP-MS中进样，测定相应的信号值。以标准溶液质量浓度为横坐标、信号强度（CPS计数）为纵坐标绘制标准曲线，外标法定量，测定4 种海蟹及其不同部位中总砷含量。

1.3.3.2 砷形态测定

色谱条件：Dionex IonPac As19阴离子交换柱（250 mm×4 mm，10 μm）及保护柱（50 mm×4 mm）；进样量50 μL；样品室温度10 ℃，柱温40 ℃；流动相为50 mmol/L、pH 9.5的(NH4)2CO3溶液；等度洗脱；流速1.0 mL/min。

质谱条件：瞬时信号采集模式，其他参数见表2所示。

1.4 数据统计与分析

采用Origin 9.1和Excel 2007软件对数据进行处理并作图，实验数据取平行实验的均值。

2 结果与分析

2.1 总砷含量测定

选用GBW10050紫菜粉和GBW10023扇贝粉作为质控样品进行总砷测定的结果质量控制，质控样标准值、测定值和相对标准偏差见表3。结果显示2 种质控样品的总砷测定值都在标准值范围内，说明采用的ICP-MS测定方法准确度高、精密度好。

表4为4 种海蟹及其不同组织中总砷含量的测定结果：从平均值进行比较，除蟹腮、壳后的整蟹中总砷测定值依次为细点圆趾蟹（4.75 mg/kg）＜青蟹（6.18 mg/kg）＜三疣梭子蟹（10.52 mg/kg）＜日本鲟（16.80 mg/kg）；同一品种的海蟹分组织部位来看，总砷含量均值基本都呈现出性腺（雌）＞肝胰腺＞蟹胸肌肉＞蟹钳肉＞蟹鳃的变化趋势。后续进一步对来自同一个样品的分部位总砷测定值进行分析，也呈现出同样的规律。结果表明海蟹是高富集砷海洋生物，性腺和肝胰腺是海蟹富集砷的主要部位。我国国家标准规定水产动物及其制品（鱼类及制品除外）无机砷含量小于0.5 mg/kg[26]，158 个海蟹总砷含量为0.37～35.81 mg/kg，因此有必要对海蟹中砷进行形态分析。

表4 4 种海蟹及其组织中总砷含量的测定Table 4 Determination of total arsenic in four sea crabs

2.2 海蟹中砷形态测定条件优化

2.2.1 色谱条件的优化

2.2.1.1 色谱柱的选择

分别采用Waters SpherisorbSAX色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）、Hamilton PRP-X100阴离子交换柱（250 mm×4.1 mm，10 μm）和Dionex IonPac As19阴离子交换柱（250 mm×4 mm，10 μm）对20 μg/L的6 种砷化合物的混合标准溶液进行分离。在尝试多种流动相组成和梯度洗脱程序下，结果发现：Waters SpherisorbSAX色谱柱分离出现干扰峰多且目标物响应值均较低（图1A）；使用Hamilton色谱柱进行分离发现，AsB和As（III）不能很好分离（图1B）；Dionex IonPac As19对AsC和AsB不能达到基线分离（图1C）。3 种色谱柱都很难实现6 种砷形态物的色谱峰完全分离。已有较多的文献表明水产品中砷元素多以AsB存在和少量的无机砷存在，AsC基本未检出，并且因无机砷毒性最强，As（III）、As（V）是水产品中必检参数，因此水产品砷元素形态分析检测中必须实现AsB和无机砷的分离。因此最终选择AsB、MMA、DMA、As（III）、As（V）这5 种砷形态为研究对象，采用Dionex IonPac As19色谱柱在6 min内将5 种砷形态完全分开（图2），且峰形尖锐，响应值高，用时短且分离效果好。

图1 不同色谱柱分离6 种砷形态色谱图Fig. 1 Chromatograms of six arsenic species on different columns

图2 Dionex IonPac As19色谱柱分离5 种砷形态色谱图Fig. 2 Chromatograms of five arsenic species on Dionex IonPac As19 column

2.2.1.2 流动相的选择

在选定的Dionex IonPac As19色谱柱下，实验对比表5中常用的5 种流动相对5 种砷形态的洗脱效果。结果显示，序号4中流动相为pH 6.0的25 mmol/L NH4H2PO4溶液时，AsB不能得到有效洗脱，且和DMA不能完全分离；序号1、2、3、5洗脱条件下，5 种不同砷形态化合物均能洗脱分离，但序号2条件下，分离效果最好，且使用等度洗脱条件，可以减少梯度洗脱需要的柱平衡时间，提高分析速度，6 min内5 种砷形态化合物全部洗脱且完全分离（图2）。通过单标定性，5 种不同化合物洗脱顺序依次为AsB、DMA、As（III）、MMA、As（V）。

表5 洗脱条件的选择Table 5 Gradient elution program of mobile phase

2.2.1.3 样品提取剂的选择

目前，常见的样品中砷形态提取剂有水、甲醇-水（1∶1，V/V）、0.15 mol/L硝酸溶液、20 mmol/L乙酸铵溶液等。水作为提取剂时一般对基质简单的样品进行提取，如大米等。甲醇-水为提取剂时，能够较好避免形态间的转化，使化合物保持自身形态[27-28]，但甲醇含量过高时会降低无机砷的提取效率和样品测定时的灵敏度，且有机相中的碳易在ICP-MS截取锥孔处富集堆积缩短锥使用寿命和影响测定结果[3]。以HPLC-ICP-MS法测定的BCR-627金枪鱼标准物质中的AsB、DMA含量与质控样标准值的比值作为提取率来比较上述4 种溶剂的提取效果。如图3所示，采用0.15 mol/L硝酸溶液和20 mmol/L乙酸铵溶液作为提取剂，对AsB和DMA的提取率最好，均大于70%，且0.15 mol/L硝酸溶液提取效率最佳，AsB、DMA平均提取率分别为89.7%和83%，因此选择0.15 mol/L硝酸溶液作为海蟹样品中砷形态测定的提取剂。

2.2.2 质谱条件的优化

2.2.2.1 质谱检测模式的选择

实验考察No Gas标准模式和He模式下，5 种砷化合物分析的响应值。结果表明在No Gas标准模式下，每种砷化合物响应均是He模式的20 倍左右，且没有出现目标物干扰峰（图4）。陈绍占等[20]在分析牛黄解毒片暴露后大鼠血清中砷形态时，也同样对两种模式下5 种砷形态化合物检出限高低以及对40Ar35Cl＋、75As检测信号的影响发现，标准模式下检出限较低且标准模式下产生的干扰峰不影响5 种砷化合物的测定。因此本实验选择标准模式进行5 种砷形态化合物的检测。

图4 质谱检测模式对砷形态物测定响应信号强度的影响Fig. 4 Effect of mass spectrometric test mode (He collision and No Gas mode) on signal response of arsenic species

2.2.2.2 补偿气流量的选择

在使用标准模式下，进一步考察载气流量和补偿气流量的最适值（图5），结果表明当载气流量为1.05 mL/min，补偿气为0 mL/min时，响应最高。陆奕娜等[29]对海产品中砷形态化合物测定时发现，补偿气为0 mL/min时，仪器灵敏度最佳且对双电荷及氧化物的干扰最小，本实验选择不使用补偿气。

图5 No Gas模式下Ar流速对砷形态物测定响应信号强度的影响Fig. 5 Effect of Ar velocity on signal response of arsenic species in No Gas mode

2.3 砷形态方法学验证

2.3.1 方法检出限及线性范围

分别配制0、10、20、50、100、300 μg/L系列砷化合物混合标准溶液，在上述优化后的一系列实验条件下进行分析。结果表明在0～300 μg/L范围内，5 种砷化物的响应色谱峰面积值与质量浓度呈良好的线性关系，相关系数均大于0.998。以实际样品测定后计算色谱图中各目标物的峰响应信噪比（RSN），得出各砷形态物的检出限（RSN=3）为0.008～0.014 mg/kg，定量限（RSN=10）为0.025～0.055 mg/kg（表6）。

表6 测定曲线线性关系及方法检出限与定量限Table 6 Calibration equations, LODs and LOQs for arsenic species

2.3.2 方法的准确度和精密度验证

准确称量BCR-627金枪鱼组织中砷形态标准物质0.5 g，其中含AsB参考值为（3.9±0.225）mg/kg，DMA含量参考值为（0.15±0.022 5）mg/kg。按照本实验方法进行的6 次平行测定结果为：AsB含量范围为3.794～4.056 mg/kg，DMA测定值范围为0.132 8～0.167 4 mg/kg，相对标准偏差分别为4.2%和4.6%，均在参考值范围内。同时采用加标回收率实验进一步验证本方法的准确度和精密度。准确称取青蟹肌肉样品18 份，分别添加3 种不同质量浓度的AsB、DMA、MMA、As（III）、As（V）5 种砷化合物混合标准溶液，使得样品添加量分别为0.40、1.00、2.00 mg/kg，每个梯度下设置6 个平行实验，进行加标回收实验，计算添加回收率和相对标准偏差，同时做样品本底值测定。如表7所示，在高、中、低3 个加标水平下，5 种不同砷形态物加标回收率在70.0%～105.0%之间，相对标准偏差均小于5%，满足分析检测要求，进一步证实了本方法测定结果准确性好、精密度高。

表7 青蟹肌肉样品中5 种砷形态物的添加回收率测定（n=6）Table 7 Spike recoveries of five arsenic species in muscle of Scylla serrata (n= 6)

2.3.3 海蟹样品中砷形态分析

图6 青蟹肌肉中5 种砷化合物色谱图Fig. 6 Chromatograms of five arsenic species in muscle of S. serrata

表8 4 种海蟹及其组织中砷化合物测定结果Table 8 Average concentrations of total arsenic and arsenic species in whole sea crabs and their tissues

运用HPLC-ICP-MS法测定4 种海蟹（青蟹、细点圆趾蟹、三疣梭子蟹和日本鲟）158 个样品及其不同组织部位中砷形态分布特征。测定色谱图及数据结果分别见图6和表8所示，4 种海蟹样品测定色谱图类似，均以AsB含量最高，其次是DMA和MMA，As（III）和As（V）仅在少量样品有检出；整蟹（除腮、壳后）及其不同部位样品中AsB占总砷含量的60.9%～99.4%，4 种海蟹AsB平均含量值依次为细点圆趾蟹＜青蟹＜三疣梭子蟹＜日本鲟，同一品种的海蟹中AsB平均含量值性腺（雌）＞肝胰腺＞蟹胸肌肉＞蟹钳肉＞蟹鳃，呈现的趋势与总砷含量一致。结果表明海蟹虽作为砷高富集品种，但主要以有机砷AsB为主，无机砷含量较低，158 个海蟹样品整蟹及分组织测定无机砷含量均值在0～0.12 mg/kg范围内，均未超过国家食品安全标准对水产动物的无机砷限值（0.5 mg/kg）要求。AsB其结构类似甜菜碱，LD50大于10 000 mg/kg，被视为无毒的有机砷形态[5,30]，在人体内不能进行代谢，直接被排出体外，通常认为不会危及人体健康[6,31]，因此海蟹虽然作为砷元素高富集生物，但无机砷含量较低，食用海蟹带来的无机砷健康风险较低。

3 结 论

采用优化后的ICP-MS法和HPLC-ICP-MS法分别测定了青蟹、三疣梭子蟹、日本鲟和细点圆趾蟹4 种常见海蟹中总砷及砷形态物分布特征。结果显示海蟹是砷高富集水产品，158 个蟹类样品中总砷含量范围为0.37～35.81 mg/kg；整蟹及分组织进行砷形态物测定数据表明海蟹体内以毒性较低的AsB为主，AsB占其总砷含量的60.9%～99.4%，158 个海蟹样品无机砷含量均值在0～0.12 mg/kg；从分品种及同一品种下分组织部位的测定结果来看，总砷含量和AsB的测定均值基本都呈现出品种上细点圆趾蟹＜青蟹＜三疣梭子蟹＜日本鲟、同一品种样品下性腺（雌）＞肝胰腺＞蟹胸肌肉＞蟹钳肉＞蟹鳃的变化趋势，说明日本鲟富集砷能力较强，性腺和肝胰腺是海蟹富集砷的重要器官。由于无机砷含量较低，均在国家标准对水产品中无机砷的规定限量值以下，因此食用海蟹带来的砷健康危害风险较低。