结直肠癌HOXA11基因启动子甲基化状态的研究

潘烽平 陈一鹏 李彦 张明明

结直肠癌是全球范围内高发病率和高死亡率的恶性肿瘤之一[1-2]。研究发现，DNA甲基化在结直肠癌发病机制中具有十分重要的作用，其中抑癌基因甲基化是近年来肿瘤表观遗传研究的热点[3]。HOXA11是一个受表观遗传调控而表达丢失的基因，异常甲基化导致HOXA11基因表达下调，影响肿瘤的发生、发展及预后。研究证实，在卵巢癌中HOXA11基因启动子CpG岛异常甲基化是其不良预后的一个独立危险因素[4]。在恶性胶质瘤中，HOXA11的异常低表达与放化疗抵抗密切相关并且影响患者的生存预后[5]。然而，HOXA11在结直肠癌中是否存在异常甲基化，HOXA11的异常甲基化是否参与调控肿瘤细胞的生物学行为目前尚未见于研究报道。本研究以结直肠癌为研究对象，探讨HOXA11在结直肠癌中的表达水平以及甲基化程度，以及HOXA11启动子区异常甲基化与患者临床病理特征间的相关性。

1 材料和方法

1.1 组织标本 89对结直肠癌组织及配对的正常肠黏膜组织标本取自于2016年8月至2018年10月在嘉兴市第一医院（55例）和浙江大学医学院附属第一医院普外科（34例）接受结直肠癌根治术的患者。所有患者术前均未接受放化疗，结直肠癌组织及配对的正常肠黏膜组织均经过病理学检查证实。此外，组织标本的使用均获得患者本人或其家属的同意，并签署书面同意书。

1.2 细胞培养 本研究选用的6种结直肠癌细胞系（HT29、SW480、HCT116、SW620、LoVo 和 SW1116）均购予上海科学院细胞库。细胞采用含有10%FBS的RPMI1640培养液，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱内培养。

1.3 主要试剂和仪器 CpGenome Universal DNA Modification kit、5-Aza-dC均购于美国Sigma-aldrich公司（批号：S7822、A3656）；Trizol试剂购于美国 Invitrogen公司（批号：15596018）；反转录试剂盒为日本TaKaRa公司产品（批号：RR047A）；SYBR Green PCR Master Mix试剂盒购于日本Toyobo公司（批号：QPK-201）。ABI 7900测序仪购于美国ABI公司。

1.4 甲基化特异性聚合酶链反应（methylation-specific PCR，MSP）检测 HOXA11甲基化状态采用酚-氯仿法抽提100mg结直肠癌和配对正常肠黏膜组织标本中的DNA，并以 CpGenome Universal DNA Modification kit试剂盒修饰DNA。甲基化引物（HOXA11-M）和非甲基化引物（HOXA11-U）分别用于扩增HOXA11基因5'CpG岛甲基化和非甲基化的等位基因，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。HOXA11-U引物序列为：5′-TGTGTGTGAAGTGATTTTTAGAGAGTAT-3′（正 义链），5′-AACAATCTCTATACACAAACTCCTCCA-3′（反义链）；HOXA11-M 引物序列为：5′-TGCGCGAAGTGATTTTTAGAGAGTAC-3′（正 义 链），5′-CAATCTCTATACACGAACTCCTCCG-3′（反义链）。MSP反应条件如下：95℃预变性 5min，95℃变性 30s，63℃退火 30s，72℃延伸 45s，共 35个循环，最后 72℃延伸 5min，4℃终止反应。最后将反应产物行2%琼脂糖凝胶电泳，电泳凝胶呈像系统照相并分析结果。

1.5 实时荧光定量PCR（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测 HOXA11 mRNA表达水平将6种结直肠癌细胞系细胞置于5-Aza-dC终浓度为20μmol/L的培养液中培养96h，行去甲基化处理。处理前后分别收集细胞，采用Trizol试剂抽提各组细胞和正常肠黏膜组织中的总RNA，按照反转录试剂盒说明书操作流程反转录合成cDNA。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，HOXA11上游引物：5'-GCAGCAGAGGAGAAAGAGGG-3′，下游引物：5'-GTGGATTTGCTGAGTAGTACTG；GAPDH 上游引物：5''-CCCATCACCATCTTCCAGGAG-3′，下游引物：5'-CTTCTCCATGGTGGTGAAGACG-3′。采用 ABI 7900测序仪进行qRT-PCR，反应条件如下：95℃预变性1min，95℃反应 10s，59℃反应 30s，共 50 个循环。每组设置3个复孔，独立重复3次，获得CT值。ΔCT为同一标本目的基因（HOXA11）与内参基因（GAPDH）CT值之差，即 ΔCT=CT（HOXA11）－CT（GAPDH），ΔΔCT=ΔCT（各组结直肠癌细胞）-ΔCT（正常肠黏膜组织）的差值，HOXA11 的相对表达量以 2－ΔΔCT表示。

1.6 统计学处理 采用SPSS 25.0统计软件。计量资料以表示，两组间比较采用t检验；组间频数比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HOXA11在结直肠癌中呈异常甲基化状态 采用MSP技术检测结直肠癌和配对正常肠黏膜组织中HOXA11基因启动子CpG岛的甲基化情况，扩增结果见图1。89例结直肠癌患者中共67例癌组织标本存在甲基化（75.3%），而正常肠黏膜组织中仅14例存在甲基化（15.7%）。上述实验结果表明，结直肠癌组织中HOXA11基因甲基化率显著高于正常肠黏膜组织（P＜0.01）。

图1 MSP检测结直肠癌组织及配对正常肠黏膜组织中HOXA11启动子甲基化状态（T：结直肠癌组织；N：正常肠黏膜组织；M：甲基化；U：非甲基化）

2.2 HOXA11基因启动子甲基化状态与其mRNA表达量的关系 发生甲基化的结直肠癌组织中HOXA11 mRNA的相对表达量明显低于较未发生甲基化的结直肠癌组织（P＜0.01），见图 2。

2.3 HOXA11基因启动子甲基化与结直肠癌患者临床病理特征的关系 结直肠癌组织中HOXA11基因启动子的甲基化状态与淋巴结转移（P＜0.01）及TMN分期（P＜0.01）密切相关，而与患者的年龄、性别、组织分化、浸润深度无关（均P＞0.05），见表1。

图2 结直肠癌组织中HOXA11甲基化状态与其mRNA表达水平的关系（**P＜0.01）

表1 HOXA11基因启动子甲基化与结直肠癌患者临床病理特征的关系

2.4 结直肠癌细胞系HOXA11基因启动子甲基化情况MSP结果显示，所有结直肠癌细胞系中HOXA11启动子均呈高甲基化状态。使用20μmol/L甲基化转移酶抑制剂5-Aza-dC处理细胞96h后，HOXA11 mRNA相对表达量均较无5-Aza-dC处理组显著升高（P＜0.05），见图3。

3 讨论

图3 5-Aza-dC处理结直肠癌细胞系后HOXA11 mRNA表达水平（*P＜0.05，**P＜0.01）

肿瘤的发生和发展是在多种致癌因素作用下，多基因参与、多步骤发生的过程，主要涉及癌基因的激活和抑癌基因的失活。DNA甲基化异常，特别是癌基因的低甲基化和抑癌基因的高甲基化，是肿瘤发生的重要机制之一[6]，其中抑癌基因通常由于过度甲基化，导致表观遗传学改变，从而抑制基因的转录和蛋白表达，参与恶性肿瘤的进展[7]。结直肠癌中广泛存在抑癌基因异常甲基化，目前研究认为，部分肿瘤相关基因甲基化是结直肠癌早期诊断及靶向治疗的生物标志[8]。因此，深入研究结直肠癌中的DNA甲基化对于肿瘤诊断和治疗具有至关重要的意义。

同源框基因（homeobox genes，HOX）主要包括 A、B、C、D四个基因簇，是一类在进化上高度保守的基因，主要参与调控胚胎发育和细胞分化。近期研究表明，HOX基因表达异常与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关[9-10]。HOXA11是HOX基因家族中的一员，位于染色体7p。最新研究结果表明，卵巢癌[4]、胶质瘤[11]、乳腺癌[12]、肾癌[13]、肺癌[14-15]和胃癌[16-17]普遍存在HOXA11异常甲基化，抑制HOXA11基因的表达，促进肿瘤的发展。

为阐明HOXA11在结直肠癌组织中的甲基化水平及其与患者临床病理特征间的关系，本研究采用MSP法对结直肠癌组织及配对正常肠黏膜组织中HOXA11基因甲基化状态进行检测。结果表明，与正常肠黏膜比较，HOXA11基因在结直肠癌组织中普遍存在异常甲基化。除此之外，结直肠癌组织中异常甲基化与淋巴结转移及TNM分期密切相关。进一步研究发现，发生甲基化的结直肠癌组织中HOXA11 mRNA表达水平显著低于未甲基化的结直肠癌组织。基因的异常甲基化会导致基因的表达沉默，笔者推测，HOXA11基因异常甲基化可能是导致HOXA11基因低表达的重要原因之一。为进一步验证推测，体外实验中使用了甲基化转移酶抑制剂5-Aza-dC，降低细胞的甲基化水平，结果提示5-AzadC作用后，6种HOXA11异常甲基化的结直肠癌细胞系中HOXA11 mRNA的表达水平显著增高，与推测一致。由此可以得出，结直肠癌组织中HOXA11基因异常甲基化抑制了HOXA11基因的转录和表达，促进肿瘤的发展。

综上所述，本研究发现结直肠癌组织中HOXA11基因普遍存在异常甲基化，抑制其转录表达。结直肠癌中HOXA11基因启动子区异常甲基化是淋巴结转移及TNM分期的危险性因素。通过本研究，笔者预测HOXA11基因甲基化检测可能是结直肠癌早期筛查及精准治疗的潜在生物标志物。