转Bt基因抗虫棉对根际土壤Bt蛋白残留和速效养分含量的影响

陈彦君，任梦云，关 潇，朱文娟，沈 奇

(1. 中国环境科学研究院，北京 100012；2. 海南大学热带农林学院，海南 海口 570228；3. 浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所, 浙江 杭州 310021)

棉花不仅是我国种植面积最大的转基因作物，更是全球性的主要经济作物和纤维作物，自其广泛种植以来，为社会带来了巨大的经济效益[1]，但与此同时，其对生态环境的潜在安全风险也越来越多地受到全球关注[2-3]。目前，国内外对转基因抗虫棉环境安全评价的研究主要集中在基因漂移、对土壤微生物数量种类和结构的影响、对非靶标动物的影响、对土壤理化性质的影响等方面。Chen等[4]的研究发现，无论是Bt棉种植还是残基掺入，均对土壤微生物有显著抑制作用。沈法富等[5]在基因漂移方面进行了较为深入的研究：陆地棉在距离<6 m时，基因漂移发生的频率较高，但随着种间距离的增加，发生基因漂移的频率呈现逐渐降低的趋势，且当种间距离达到36 m时，基因漂移发生的概率几乎为0；海岛棉在种间距离需达到72 m才可避免基因漂移的发生。Wilson等[6]通过田间调查发现，转基因抗虫棉会因为对鳞翅目害虫的显著影响而对甘薯白粉虱产生间接影响，造成其种群的增长。

土壤生态系统是转基因作物外源基因及其产物表达的重要场所，在作物生长过程中，根系分泌是Bt蛋白进入土壤的重要方式，土壤生态系统中特定生物功能类群都有可能因此发生改变。速效养分是植物生长发育过程中必不可少的营养物质，可直接参与土壤的生物化学转化过程[7]，是评价土壤质量的重要指标。本文以转基因抗虫棉为研究对象，重点讨论其对根际土壤Bt蛋白残留及根际土壤速效养分含量的影响，为转基因抗虫棉的环境安全评价提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究区域概况

试验地位于山东省高青县棉花种植示范基地，地理位置为118°00′N，37°09′E，属于温带性季风气候，年平均气温为11～14℃，年平均降水量598.1 mm，平均蒸发量为1 589.4 mm。全年无霜期180～200 d，光热资源丰富，年日照时数2 300～2 900 h。4个品种转基因抗虫棉及其对照常规棉种植环境一致。

1.2 供试材料

供试棉花为转基因抗虫棉鲁棉研28号及其对照常规棉CK1；鲁棉研36号及其对照常规棉CK2；山农棉8号及其对照常规棉CK3；鑫秋4号及其对照常规棉CK4。试验于2016年5-8月进行，水肥管理采用常规管理。

1.3 样品采集

试验采用随机区组设计，每个处理4个重复。分别在各块棉田棉花生长的苗期、蕾期、花铃期、吐絮期进行土壤样品采集。按五点取样法混合取样，同时避开道路等可能影响因素。采样时去除表面杂草，用“抖根法”取根际土壤，用冰盒保存，带回实验室。一部分土样保存于-80℃，进行土壤Bt蛋白残留量检测；一部分土样自然风干，过1.00 mm筛，进行速效养分含量的检测。

1.4 测定方法

1.4.1Bt蛋白残留的测定 采用美国Envirologix公司的ELISA试剂盒，测定棉花根际土壤的Bt蛋白残留量。

1.4.2 土壤养分含量的测定 土壤养分的测定参照鲍士旦方法进行[8]：硝态氮含量的测定采用紫外分光光度法，铵态氮含量的测定采用靛酚蓝比色法，速效磷含量的测定采用钼锑抗比色法。

1.5 数据统计与分析

采用SPSS 22.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析(One-way ANOVA)和LSD多重比较分析试验数据的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 不同生育期转基因抗虫棉根际土壤中Bt蛋白含量

4个品种转基因抗虫棉根际土壤Bt蛋白残留量在各生育期均显著高于对照常规棉(P<0.05，图1)，且在整个生长期呈现先升高后降低的趋势，蕾期蛋白残留量达到最大。鲁棉研28号在苗期、蕾期、花铃期、吐絮期分别显著高于其对照常规棉427.94%，1029.66%，661.15%，353.98%。鲁棉研36号在苗期、蕾期、花铃期、吐絮期分别显著高于其对照常规棉393.24%、2573.45%、638.10%、885.53%。山农棉8号在苗期、蕾期、花铃期、吐絮期分别显著高于其对照常规棉1 208.89%、717.94%、836.36%、264.76%。鑫秋4号在苗期、蕾期、花铃期、吐絮期分别显著高于其对照常规棉423.10%、764.74%、793.18%、342.43%。

2.2 转基因抗虫棉根际土壤速效养分含量

2.2.1 转基因抗虫棉根际土壤硝态氮含量 4个品种转基因抗虫棉及其对照常规棉在整个生长期根际土壤硝态氮含量均表现为苗期最高，吐絮期最低(图2)。鲁棉研28号在苗期低于对照常规棉18.32%，在蕾期低于对照常规棉5.98%，在花铃期高于对照常规棉5.50%(P<0.05)，在吐絮期与对照常规棉差异不显著(P>0.05)；鲁棉研36号在苗期显著低于对照常规棉2.66%，在花铃期显著高于对照常规棉5.50%，在蕾期、吐絮期与对照常规棉差异不显著；山农棉8号在苗期显著低于对照常规棉16.78%，在蕾期显著低于对照常规棉10.23%，在花铃期、吐絮期与对照常规棉差异不显著；鑫秋4号及其对照常规棉在苗期、花铃期、吐絮期差异不显著，仅在蕾期显著低于对照常规棉8.74%。

2.2.2 转基因抗虫棉根际土壤铵态氮含量 4个品种转基因抗虫棉及对照常规棉整个生长期的根际土壤铵态氮含量均呈下降趋势,表现为苗期含量最高，吐絮期含量最低(图3)。鲁棉研28号在蕾期显著低于对照常规棉11.51%，在花铃期显著低于对照常规棉28.22%，在苗期、吐絮期与对照常规棉差异不显著；鲁棉研36号在蕾期显著低于对照常规棉15.22%，在花铃期显著低于对照常规棉26.52%，在苗期、吐絮期与对照常规棉差异不显著；山农棉8号根际土壤铵态氮含量在各生育期均低于对照常规棉，其在蕾期显著低于对照常规棉12.57%，在花铃期显著低于对照常规棉25.50%，在苗期、吐絮期与对照常规棉差异不显著；鑫秋4号在蕾期、花铃期分别显著低于对照常规棉3.47%和21.53%，在吐絮期显著高于对照常规棉6.22%，在苗期与对照常规棉差异不显著。

注：直方柱上方标不同字母表示差异显著水平(P<0.05)，下同。Note: The different letters above the straight square column indicate significant difference (P<0.05), the same below.图1 转基因抗虫棉根际土壤Bt蛋白残留量Fig.1 Residues of Bt protein in rhizosphere soil of transgenic Bt cotton

图2 转基因抗虫棉根际土壤硝态氮含量Fig.2 The content of nitrate nitrogen in transgenic Bt cotton rhizosphere soil

图3 转基因抗虫棉根际土壤铵态氮含量Fig.3 The content of ammonium nitrogen in transgenic Bt cotton rhizosphere soil

2.2.3 转基因抗虫棉根际土壤速效磷含量 在棉花的整个生长期，4个品种转基因抗虫棉及其对照常规棉根际土壤速效磷含量均呈上升趋势，表现为苗期含量最低，吐絮期含量最高(图4)。鲁棉研28号根际土壤速效磷含量始终高于对照常规棉，其在蕾期和吐絮期分别显著高于对照常规棉10.29%和8.59%，在苗期、花铃期与对照常规棉差异不显著；鲁棉研36号在苗期显著高于对照常规棉6.77%，在蕾期、花铃期、吐絮期均与对照常规棉差异均不显著；山农棉8号、鑫秋4号在4个生育期均与对照常规棉差异不显著。

图4 转基因抗虫棉根际土壤速效磷含量Fig.4 The content of available phosphorus in transgenic Bt cotton rhizosphere soil

3 讨 论

研究结果显示，4个品种转基因抗虫棉根际土壤中Bt蛋白残留量在整个生长期均呈先升高后降低的趋势，且均显著高于对照常规棉。这与许多专家学者研究结果较为一致[9-12]，但也有研究得出了不同的结果，如张莉等[13]检测不同地区不同生育期Bt-SY63稻田土壤Bt蛋白的残留，大部分都未检测到Bt蛋白。刘蔸蔸[14]检测经3种不同方法处理过的转基因抗虫棉土壤，均未检测到Bt蛋白的残留。造成试验结果差异的原因可能有：试验所用ELISA试剂盒不同，其对蛋白的检测限不同，低于检测限的浓度都不能被准确检测；试验选用的棉花品种不同，Bt蛋白的表达规律也不尽相同[11]；试验地不同，土壤微生物组成、土壤水分和环境条件等均可能影响土壤中Bt蛋白的降解；土壤粒径成分不同，对土壤的吸附程度不同，进而造成蛋白残留量的不同[15-16]。

随生育期的推进，4个品种转基因抗虫棉及其对照常规棉根际土壤中硝态氮含量呈下降的趋势，虽因品种不同下降的程度不同，但均为生长后期显著低于生长前期，吐絮期的硝态氮含量最低，这说明生育期是影响棉花根际土壤硝态氮含量的主要因素[17]。此外，鲁棉研36号、鑫秋4号硝态氮的含量显著低于同期对照常规棉。这与赵云丽等[18]的研究结果较为相似。可能是因为外源基因的导入促进根系更多地吸收土壤中的硝态氮[19]，使其在生长前期对硝态氮的吸收和利用率优于亲本。

转基因抗虫棉及其对照常规棉根际土壤铵态氮的含量随生育期的推进呈下降趋势。这表明，随生育期的推进，棉花对铵态氮的需求量不断增加[20]。

因棉花品种不同，根际土壤铵态氮含量存在一定差异，4个品种转基因抗虫棉均表现出与对照常规棉的显著性差异，这与部分已有研究结果较为相似[21]，根际土壤铵态氮含量可能通过土壤微生物的氨化强度或根系分泌物化学成分变化这两个途径发生改变。但也与许多研究结果存在差异，娜日苏等[22]研究发现，播种后的60、90 d，供试2种棉花铵态氮含量无显著差异。本试验与其他研究[23]结论不同可能是因为不同的气候和土壤状况对根系分泌的Bt外源基因及其表达产物产生了影响，从而影响了这两个途径，使根际土壤铵态氮的含量发生了变化。

在棉花的整个生长期，4个品种转基因抗虫棉及其对照常规棉根际土壤速效磷含量均呈上升的趋势，这与乌兰图雅等[21]的研究结果较为一致。试验结果也得出，鲁棉研28号、鲁棉研36号根际土壤速效磷含量均显著高于对照常规棉，说明转基因抗虫棉可促进磷素向速效态转换[24]，但不同品种转基因棉花对转换的促进程度不同。但也有研究得出了不同的结论，Yang等[25]通过盆栽试验得出，转基因棉花的种植可显著降低花铃期根际土壤中速效磷的含量。这与本试验结果存在差异，造成差异的原因可能是不同地区、不同年份土壤状况和气候状况等不同，使种植转基因作物对土壤营养物质转化的影响不同[21]。

综上所述，生育期和转基因抗虫棉的种植是影响棉花根际Bt蛋白残留量、速效养分含量的主要因素，棉花品种也会对其产生一定的影响。就目前已有研究结果来看，转基因抗虫棉种植对土壤生态环境影响存在不同程度的差异，这可能是棉田生态条件、材料选取、施肥管理等各类因素造成的。因此，对于转基因抗虫棉对根际土壤Bt蛋白残留和速效养分含量影响的研究仍需进行长期的跟踪试验，以期得到更为明确的结论。