梅毒螺旋体重组蛋白Tp0453-Gpd的表达及免疫性研究

韩 雪，崔勇青，胡子颖，魏仙萍，黄亚辉，孔令保,郑 义

(1.江汉大学 生命科学学院，湖北 武汉 430056； 2.江西农业大学 生物科学与工程学院，江西 南昌 330045；3.花都市人民医院 检验科，广东 花都 510800)

梅毒密螺旋体苍白亚种(Treponemapallidumsubsp. pallidum，简称TP)是梅毒(Syphilis)的病原体，主要通过性行为进行传播，会导致心血管及中枢神经系统损害等严重后果[1-2].目前，以青霉素为主的抗生素疗法是治疗梅毒的主要手段[3]，但由于梅毒诊断方法不够完善，导致很多患者错过了最佳治疗时期[4].此外，梅毒病原体目前不能进行体外培养，相关蛋白功能难以鉴定，使疫苗的研究进展非常缓慢，仅灭活疫苗研究有初步报道[5].在我国，梅毒发病人数呈快速增加趋势，病例数从2009年32万增加到2017年46万.

梅毒螺旋体的基因组全长为1 138 006 bp，其主要抗原集中在外膜蛋白和脂蛋白中.Tp0453蛋白位于梅毒螺旋体的外膜，全长287 aa，分子量为32 kD.Tp0453蛋白免疫原性强，分子结构以螺旋为主结，无片层结构，研究表明，其与梅毒血清抗体反应灵敏度和特异性高，且与其他螺旋体及细菌无交叉反应，可用于梅毒抗体检测[6-8]，同时其含有多个抗原决定簇，可刺激机体产生保护性抗体[9].Gpd为梅毒螺旋体脂蛋白，位于外膜上，含有357 aa,蛋白分子量约为40 kD.对不同梅毒螺旋体株的Gpd氨基酸序列进行比对分析，发现其序列高度保守,但与其他细菌同源性低[10].利用重组Gpd蛋白作为抗原，可以对梅毒患者血清实现特异性检出[8]；重组Gpd蛋白及Gpd核酸疫苗免疫家兔，可使家兔产生特异性抗体[11-12].因此, Gpd蛋白可作为梅毒诊断试剂及疫苗研制的一个候选蛋白.

笔者利用大肠杆菌表达梅毒重组蛋白Tp0453-Gpd，该蛋白含有Tp0453蛋白(56—287 aa)片段及Gpd全蛋白.以重组蛋白作为抗原，对人血清样本进行梅毒特异性抗体检测，梅毒患者样本组与非梅毒患者样本组的结果存在非常显著性差异，表明融合蛋白可被梅毒抗体特异性识别，具有免疫反应性.利用重组蛋白免疫新西兰兔，兔血清中可检测到高水平梅毒抗体，说明重组蛋白具有良好免疫原性.因此，笔者实验中所表达的梅毒重组蛋白Tp0453-Gpd可以作为梅毒诊断试剂及蛋白疫苗的理想候选抗原.

1 材料与方法

1.1 实验材料

人工合成梅毒重组Tp0453-Gpd蛋白基因，由上海宇玫博生物科技有限公司完成，并连接到载体PET-HIS-28a上，构建PET-HIS-28a-Tp0453-Gpd重组质粒.大肠杆菌Escherichiacoli(E.coli)BL21(DE3)为笔者实验室保存.12份梅毒阳性血清(TPPA及临床确诊阳性)及12份梅毒阴性血清(TPPA及临床确诊阴性)，由花都市人民医院郑义博士提供.

1.2 方 法

蛋白表达：重组质粒Tp0453-Gpd转化到大肠杆菌E．coliBL21(DE3)中，37 ℃过夜培养后，10%转种SOB，37 ℃培养2.5 h，然后在异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside，简称IPTG)浓度为1.5 mmol·L-1,28 ℃条件下诱导表达8 h，转速为220 r·min-1.

蛋白纯化：菌体超声波处理后，离心取包涵体沉淀，包涵体尿素重溶，加入咪唑进行镍柱亲合层析，并利用尿素浓度为6 N的IMAC-5，20，40，80，100，200梯度洗脱液进行洗脱.各洗脱组分PBS缓冲液4 ℃透析24 h.

Western blot鉴定：蛋白SDS-PAGE电泳后，转移到PVDF上，BSA封闭后，以梅毒抗体阳性血清为一抗(阴性对照中一抗为梅毒抗体阴性血清)，羊抗人IgG为二抗，DAB显色.

人血清抗体检测：重组蛋白Tp0453-Gpd包板，脱脂牛奶封闭后，一抗为待测人血清，二抗为羊抗人IgG，TMB显色，检测吸光度.

数据处理：酶联免疫血清反应检测结果利用生物统计学软件SPSS进行显著性分析.

注射样品制备：纯化好的重组蛋白50 μg,均匀重悬于200 μL PBS缓冲液,等体积佐剂乳化，第1针佐剂为CFA，第2，3针佐剂为IFA.

免疫家兔及血清采样：雄性新西兰兔分别在第1，7，14天注射重组融合蛋白疫苗1次.耳缘处每周取血样1次.

兔抗血清效价检测(ELISA)：重组蛋白Tp0453-Gpd包被酶标板，BSA封闭，一抗为100 μL兔血清，37 ℃孵育2 h；二抗为100 μL羊抗兔IgG，37 ℃静置1 h；TMB显色，硫酸终止反应，酶标仪450 nm条件下测量吸光值(OD450).

2 结果与分析

2.1 重组蛋白Tp0453-Gpd表达与纯化

基因工程菌被诱导表达后，对所表达的重组蛋白进行纯化，经SDS-PAGE凝胶电泳检测，结果如图1所示.

M:蛋白质Marker;1:诱导前菌体上清液；2：诱导后菌体上清液；3.诱导后菌体沉淀物；4：纯化的蛋白.图1 重组蛋白Tp0453-Gpd表达与纯化

从图1可知，基因工程菌诱导表达8 h后，在重组蛋白预期分子量64 kD处出现了明显蛋白表达带，而诱导前菌体样本无此条带出现，说明重组Tp0453-Gpd蛋白被成功表达.超声波处理后，发现重组蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式存在.重组蛋白包涵体经过镍柱亲合层析后，得到纯化的梅毒重组蛋白Tp0453-Gpd.

2.2 重组蛋白Tp0453-Gpd的免疫反应性分析

梅毒抗体阳性血清样本来自TPPA确诊梅毒患者，梅毒抗体阴性血清样本来自TPPA确诊非梅毒患者.重组蛋白Western blot结果如图2所示.

以重组蛋白为抗原包被酶标板，酶联免疫法检测待测人血清中梅毒特异性抗体，结果如图3所示.

(a)为重组蛋白孵育梅毒抗体阳性血清结果；(b)为重组蛋白孵育梅毒抗体阴性结果.图2 Tp0453-Gpd抗原特异性检测

图3 Tp0453-Gpd与人血清反应性的统计学分析

图2显示，一抗孵育梅毒患者血清的样品出现特异性带，而一抗为梅毒阴性血清孵育的样品没有任何带，说明Tp0453-Gpd蛋白可以被梅毒患者血清中的梅毒抗体特异性识别.

由图3可以看出，梅毒患者血清样本平均OD450值为P=1.02，非梅毒患者血清平均OD450值为N=0.22，P/N=4.6.数据进行方差分析后，得到p<0.01，表明梅毒血清样本组与非梅毒血清组样本组的检测结果存在极其显著性差异，重组蛋白血清学检测结果与TPPA检测结果符合度为100%.

2.3 重组蛋白Tp0453-Gpd免疫原性分析

对免疫后的新西兰兔进行不同时间段取血，酶联免疫法检测兔血清中抗体滴度水平，结果如图4所示.

图4 Tp0453-Gpd抗体滴度与免疫时间关系示意图

由图4可知，免疫家兔血清中，第4周开始可以检测出特异性抗体，此后抗体滴度迅速增加，并在第14周达到最高峰为1∶2 000，第15周抗体滴度开始缓慢下降，至检测周期(20周)内抗体滴度依旧保持在一个较高水平.

3 讨 论

目前主要采用TPPA法对梅毒进行确诊,该方法是利用梅毒螺旋体作为抗原，通过检测血清中梅毒抗体来确诊梅毒螺旋体感染，但由于现阶段梅毒螺旋体只能在雄性兔子睾丸中进行扩增，增殖效率低，并且操作繁琐，提纯困难，因此造成TPPA检测试剂成本高，售价昂贵；另外，TPPA法结果的判断主观性强，需要实验人员有丰富的经验，所以不适合基层医院大规模推广，利用梅毒特异性抗原进行血清学检测是目前梅毒检测的研究热点.TP外膜蛋白Tp0453及脂蛋白Gpd均有一定免疫原性，研究报道这两个蛋白可识别梅毒患者血清中的梅毒抗体，是梅毒新型诊断试剂候选蛋白[8，12-13].Tp0453虽然对各期梅毒可以检出，但对潜伏期梅毒检测结果稳定性不太理想，而Gpd对潜伏期检测结果比较稳定[8].笔者通过基因工程手段，利用大肠杆菌表达梅毒重组融合蛋白Tp0453-Gpd，重组蛋白融合了Tp0453(56—287 aa)片段及Gpd全片段，包涵了蛋白Tp0453及Gpd重要抗原表位.Tp0453蛋白1—55位氨基酸免疫原性不强，且疏水性氨基酸过于密集，不利于表达，所以被去除.以重组蛋白Tp0453-Gpd作为抗原，通过ELISA检测人血清样本，发现梅毒患者样本组吸光平均值为1.02，非梅毒患者样本组吸光平均值为0.22，p<0.01,说明梅毒患者血清组和非梅毒患者血清组检测结果存在极显著差别，检测结果与TPPA检测结果符合度为100%.研究报道，利用重组Tp0453检测病人血清中的梅毒抗体与TPPA符合度为100%[8-9,13]，TpGpd重组蛋白检测结果与TPPA符合率达93%[8,12]，与文中研究结果类似.因此，该文中所表达的重组蛋白Tp0453-Gpd具有良好的免疫反应性，可作为梅毒诊断试剂的候选蛋白.

现阶段，梅毒螺旋体活体培养效率低，梅毒蛋白功能所知尚少，也没有合适的动物模型，这些问题导致梅毒疫苗研发进展缓慢[14].在梅毒螺旋体感染早期，巨噬细胞的吞噬和抗体的中和作用是机体清除病原体的主要方式[15]，因此，如何让机体有效产生抗体是梅毒疫苗设计的重点，Tp0453、Gpd是梅毒外膜蛋白中免疫原性强的蛋白，拥有多个重要抗原决定簇，具有成为梅毒蛋白疫苗主要成分的潜质[15-17].笔者研究所表达的重组蛋白含有Tp0453、Gpd蛋白的抗原决定簇，使重组融合蛋白具备刺激机体产生梅毒特异性抗体的潜力.重组蛋白免疫家兔实验表明，家兔血清中第4周起内可以检测到抗体，并长时间维持在一个较高滴度水平，说明融合蛋白的抗原决定簇得到较好的暴露和提成，有效刺激了机体产生梅毒特异性抗体，也说明蛋白具有良好的免疫原性.该重组蛋白Tp0453-Gpd免疫兔子，血清抗体滴度达到1∶2 000以上.之前所报道的重组蛋白TP0453免疫家兔后，抗体滴度达到1∶1 280[9]；重组Gpd蛋白免疫家兔后抗体滴度达到1∶1 280[12]；Gpd核酸疫苗免疫家兔后抗体最高达到1∶1 024[17].

笔者在大肠杆菌中首次成功表达了梅毒重组融合蛋白Tp0453-Gpd，该重组蛋白可被梅毒患者血清抗体特异性识别，有良好的免疫反应性.蛋白免疫家兔后，可刺激家兔产生高水平特异性抗体，有一定免疫原性.因此，梅毒重组融合蛋白Tp0453-Gpd可作为梅毒诊断试剂抗原和梅毒疫苗的候选蛋白，但现阶段融合蛋白表达水平还有待提高，此外，对更大量血清样本的检测，融合蛋白刺激机体产生的抗体对梅毒的中和作用是下一步研究的内容.