糖基化亚硝基血红蛋白色素特性的研究

张军，王英平，王建化*

(1.青岛农业大学 海都学院，山东 莱阳 265200；2.黄岛海关，山东 黄岛 266000)

亚硝基血红蛋白可以作为发色、发香剂应用在肉品加工中，以减少亚硝酸盐的使用量[1]，但其中的色素物质易受环境影响发生降解及褪色。因此，使用蛋白质糖基化反应来合成制备糖基化亚硝基血红蛋白色素，以提高其物化特性，并降低其使用量，保持色泽。

1990年，有研究者试着通过美拉德反应制备蛋白与糖的复合物改善蛋白化学改性的弊端[2]。2005年，杨锡洪以血红蛋白制备色素替代亚硝酸盐发色的研究，确定了亚硝基糖基化的最佳条件。还有研究者研究了乳清蛋白糖基化反应特性及抗氧化性等，采用7种不同的糖基配体，对乳清蛋白与不同糖基复合物反应特性及抗氧化特性进行研究[3]。彭善丽、张根义进行了茶多酚对蛋白质糖基化作用的研究，通过测定小鼠血清中的糖化血红蛋白和糖基化的最终产物荧光强度的变化情况来了解茶多酚对高糖机体内糖基化蛋白质的作用[4]。2015年，李飞等人对糖基化亚硝基蛋白的稳定性及其在猪肉脯中的应用进行了探究[5]。

糖化蛋白是生物化学现象，但把糖化蛋白的功能特性应用于食品工业是一个崭新的研究领域。本实验采用新鲜猪血为原料，制备血红蛋白，一定条件下与亚硝酸盐反应生成亚硝基血红蛋白，经糖基化得到糖基化亚硝基血红蛋白色素，探究糖基化亚硝基血红蛋白色素溶解性和稳定性的影响因素。

1 材料与仪器

1.1 主要材料与试剂

新鲜猪血：购自莱阳龙大现取猪血；柠檬酸钠、亚硝酸钠、盐酸、氢氧化钠：均为分析纯，莱阳康德化工有限公司；氯化钠、氯化钙、氯化镁、氯化钾：均为1.0 mol/L标准溶液，国药集团化学试剂有限公司；可溶性壳聚糖：标准试剂，济南海得贝海洋生物工程有限公司。

1.2 主要仪器

JY92-IIYJ超声波细胞破碎仪 南京以马内利仪器设备有限公司；SCIENTZ-10N真空冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司；TU-1901紫外可见分光光度计 北京普析实验仪器有限公司；PL4001-L分析天平 赛多利斯科学仪器有限公司；H-1650离心机 湘仪离心机仪器有限公司。

2 实验方法

2.1 糖基化亚硝基血红蛋白色素的制备流程

糖基化亚硝基血红蛋白色素的制备流程见图1。

图1 糖基化亚硝基血红蛋白色素制备流程图Fig.1 Flow chart for preparation of glycosylated nitrosohemoglobin pigments

2.1.1 血红蛋白的制备

将从莱阳龙大公司取出的新鲜猪血，加入15%的柠檬酸钠溶液，然后在0～-5 ℃环境下冷藏10～24 h。

将冷藏的新鲜猪血取出离心(3000 r/min，15 min)。

将上清液倒掉，取下层沉淀，加入少量蒸馏水，搅拌5 min,在细胞破碎仪中破碎，破碎温度60 ℃、破碎时间12 min、破碎频率2/3，然后以1.0 mol/L的盐酸调节pH值至6.2。

2.1.2 亚硝基血红蛋白的制备

取已调节好pH值的血红蛋白溶液1000 mL,添加8 g亚硝酸钠和3.6 g异抗坏血酸钠，然后搅拌均匀。

将搅拌均匀后的溶液在35 ℃恒温水浴锅中加热2～3 h，离心(3000 r/min,15 min)除去残渣，得到亚硝基血红蛋白溶液[6]。

2.1.3 糖基化亚硝基血红蛋白色素的制备

添加可溶性壳聚糖(可溶性壳聚糖溶液浓度∶亚硝基血红蛋白浓度为1∶5)，均匀后，以盐酸溶液将pH值调至5.0。

将调节好的溶液于60 ℃恒温水浴锅内缓慢搅拌，时间20 min，反应完全后离心，除去沉淀。

将所制得的亚硝基血红蛋白和糖基化亚硝基血红蛋白色素溶液平均分成两组，一组放在60 ℃的烘箱中烘干，另外一组经冷冻干燥制成冻干粉。

用研钵将烘干和冻干的亚硝基血红蛋白色素和糖基化亚硝基血红蛋白色素研成粉末，冷藏备用。

2.2 糖基化亚硝基血红蛋白色素溶解性的测定

2.2.1 干燥方式对糖基化亚硝基血红蛋白色素溶解性的影响

将真空冷冻干燥和60 ℃条件下烘干的糖基化亚硝基血红蛋白色素粉末分别称取1.0 g，然后用量筒分别量取10 mL的蒸馏水，于烧杯中进行溶解，观察其溶解性的变化。

2.2.2 温度对糖基化亚硝基血红蛋白色素溶解性的影响

将糖基化亚硝基血红蛋白色素各0.1 g置于烧杯中，然后用量筒分别量取10 mL在室温、60 ℃、80 ℃等条件下加热的蒸馏水，在烧杯中溶解，然后观察不同温度下的溶解情况。

2.3 糖基化亚硝基血红蛋白色素稳定性的测定

2.3.1 不同贮藏温度对糖基化亚硝基血红蛋白色素稳定性的影响

将糖基化亚硝基血红蛋白色素粉色素置于密封袋中，于室温、4 ℃、-18 ℃条件下避光贮藏，每隔24 h取0.1 g，加入10 mL丙酮溶液后过滤，于波长540 nm处测定滤液的吸光度[7]。

2.3.2 光照对糖基化亚硝基血红蛋白色素稳定性的影响

将1.0 g糖基化亚硝基血红蛋白色素放置于室外光、室内自然光、室内暗处等未封闭培养皿中，一定时间各取0.1 g色素，加入10 mL丙酮溶液后过滤，于波长540 nm处测定其吸光度。

2.3.3 氧化剂对糖基化亚硝基血红蛋白色素稳定性的影响[8]

向10 mL不同浓度的过氧化氢溶液中各加入1.0 g糖基化亚硝基血红蛋白色素，避光放于暗处，每隔24 h，观察样品的颜色变化情况，离心沉淀，加入10 mL丙酮溶液过滤，于波长540 nm处测定吸光度。

2.3.4 金属离子对糖基化亚硝基血红蛋白色素稳定性的影响

将1.0 g糖基化亚硝基血红蛋白色素，分别与10 mL浓度为1.0 mol/L的各种金属离子，如氯化钠、氯化钾、氯化钙以及氯化镁溶液混合，以水为对照样，密封后置于暗处，在不同时间观察样品在氯化钙溶液中的颜色变化，离心沉淀，加入10 mL丙酮溶液后过滤，于波长540 nm处测吸光度。

2.3.5 温度对糖基化亚硝基血红蛋白色素稳定性的影响

将1.0 g糖基化亚硝基血红蛋白色素，在温度为75，85，95 ℃条件下恒温水浴加热15 min，观察其色泽变化情况。

3 实验结果

3.1 不同处理方式对糖基化亚硝基血红蛋白色素溶解性的影响

3.1.1 干燥方式对糖基化亚硝基血红蛋白色素溶解性的影响

表1 不同干燥方式对色素溶解性的影响Table 1 Effects of different drying methods on the solubility of pigments

由表1可知，不同的干燥条件下糖基化亚硝基血红蛋白色素溶解性不同，真空冷冻条件下，糖基化亚硝基血红蛋白色素完全溶解而且速度快，因真空冻干条件下不影响色素原有的结构，其复水性强。

3.1.2 温度对糖基化亚硝基血红蛋白色素溶解性的影响

表2 不同温度条件下对色素溶解性的影响Table 2 Effects of different temperatures on the solubility of pigments

由表2可知，糖基化亚硝基血红蛋白色素的溶解性在室温、60 ℃时高于80 ℃时的溶解性，且60 ℃比室温时溶解性略好，因其温度较低溶解不够充分，温度过高，蛋白质容易发生变形。由此可见，糖基化亚硝基血红蛋白色素适宜在60 ℃下溶解。

3.2 影响糖基化亚硝基血红蛋白色素稳定性的因素

3.2.1 贮藏温度对糖基化亚硝基血红蛋白色素稳定性的影响

图2 糖基化亚硝基血红蛋白色素贮藏稳定性变化Fig.2 Changes of storage stability of glycosylated nitrosohemoglobin pigments

由图2可知，在540 nm处测定3种贮藏温度下糖基化亚硝基血红蛋白色素吸光度的变化。在-18 ℃条件下糖基化亚硝基血红蛋白色素吸光度最大并且变化幅度较小，4 ℃次之，而室温下吸光度明显降低。所以，糖基化亚硝基血红蛋白色素最好在低温条件下贮藏。

3.2.2 光照对糖基化亚硝基血红蛋白色素稳定性的影响

图3 光照对糖基化亚硝基血红蛋白色素稳定性的影响Fig.3 Effects of illumination on the stability of glycosylated nitrosohemoglobin pigments

由图3可知，光照条件变化，其吸光度变化情况存在差别。在室内暗处，糖基化亚硝基血红蛋白色素吸光度最大并且变化幅度较小，而在室外光照下，吸光度明显降低且变化幅度明显增大，室内自然光照下介于两者之间。由此可得，室内暗处糖基化亚硝基血红蛋白色素稳定性优于其他两种情况。

3.2.3 不同浓度氧化剂对糖基化亚硝基血红蛋白色素稳定性的影响

图4 氧化剂对糖基化亚硝基血红蛋白色素稳定性的影响Fig.4 Effects of oxidants on the stability of glycosylated nitrosohemoglobin pigments

由图4可知，糖基化亚硝基血红蛋白色素在不同浓度的过氧化氢溶液下吸光度发生了明显的变化。起始时间,糖基化亚硝基血红蛋白色素在不同浓度的过氧化氢溶液中吸光度都明显下降并且下降幅度较大，两种溶液下吸光度非常相近，但随着时间的延长，20%过氧化氢的下降幅度增大，而15%过氧化氢的下降幅度减缓。由图4可知，氧化剂对糖基化亚硝基血红蛋白色素稳定性有较大影响，并且随过氧化氢浓度的增大而呈现增大的趋势。总而言之，氧气是糖基化亚硝基血红蛋白色素稳定性的一个重要因素。

3.2.4 金属离子对糖基化亚硝基血红蛋白色素稳定性的影响

图5 金属离子对糖基化亚硝基血红蛋白色素稳定性的影响Fig.5 Effects of metal ions on the stability of glycosylated nitrosohemoglobin pigments

由图5可知，糖基化亚硝基血红蛋白色素在氯化镁溶液中吸光度最大并且变化幅度较小，在氯化钠和氯化钾溶液中两者吸光度变化曲线基本相同，在氯化钙溶液中糖基化亚硝基血红蛋白色素溶液吸光度值最小。由此可见，金属离子也是影响色素稳定性的一个方面，Ca2+相对于Na+、K+、Mg2+而言，稳定性明显偏差。

4 结论

本实验研究了影响色素溶解性和稳定性的重要因素。糖基化后的色素具有溶解性更好、稳定性更高等特点，这也是人们在生产中考虑是否将糖基化亚硝基血红蛋白色素应用于食品肉制品加工中的重要因素。本实验在干燥方式和温度等方面对糖基化亚硝基血红蛋白色素的溶解性进行了探究，对不同贮藏温度、光照和氧化剂以及金属离子对糖基化亚硝基血红蛋白色素的稳定性进行了探究。结果证明，糖基化亚硝基血红蛋白色素在真空冷冻干燥、60 ℃条件下溶解性较好，在-18 ℃贮藏、室内暗光、15%过氧化氢、氯化镁溶液中稳定性较强。