热休克蛋白27通过降低内质网应激抑制硼替佐米诱导的骨髓瘤细胞凋亡

尚 晋， 王志红， 陈志忠， 魏天南 ， 吴文冰， 陈为民

HSP27是小分子热休克蛋白(small heat shock protein，sHsp)家族的一员，是一个重要的分子伴侣，生理状态下机体表达构成型HSP27，具有广泛的生物学作用；在高温、感染、创伤等“应激”条件下表达诱导型HSP27，可协助细胞内多种蛋白正确折叠和跨膜转运，介导错配蛋白的降解，维持细胞蛋白质代谢平衡[1]。HSP27在胃、肝、胰腺、结直肠等多种实体肿瘤中高表达[2]，与肿瘤转移、化疗耐药、不良预后密切相关[3-4]。研究发现，热休克蛋白家族成员HSP90在多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)患者的骨髓瘤细胞中表达上调，抑制HSP90可诱导骨髓瘤细胞凋亡[5]。HSP90表达与骨髓瘤的临床分期、肿瘤负荷和疗效相关，可作为判断预后的重要指标[6]。MM是一种异质性很强的浆细胞来源的恶性肿瘤，约占血液系统恶性肿瘤的10%，好发于中老年人，目前仍然是一种不可治愈的疾病[7]。硼替佐米(bortezomib，BTZ)是26S蛋白酶体糜蛋白酶样活性的可逆抑制剂，以BTZ为代表的新药治疗MM患者总体有效率高达80%～90%，而且提高了缓解的深度，改善了生存质量和生存时间[8]。但多个临床资料显示，部分MM患者对BTZ原发或继发耐药[9-10]，严重影响BTZ的临床疗效。近年来的研究发现，骨髓瘤恶性增殖的过程中，细胞内产生大量异常免疫球蛋白，内质网应激增强[11]，BTZ过度激活内质网应激，诱导骨髓瘤细胞凋亡，是不同于内源性线粒体途径和外源性死亡受体途径的全新凋亡途径[12]。另一方面，HSP27等多种热休克蛋白在药物刺激等应激状态下表达上调，对内质网应激发挥重要调节作用[13]，提示HSP27与内质网应激相互作用，介导骨髓瘤细胞对BTZ耐药，具体机制不明。

本研究以人骨髓瘤细胞株U266，NCI-H929，MM1S及MM患者CD38+/CD138+浆细胞为研究对象，观察BTZ对HSP27表达的影响，采用RNA干扰技术抑制HSP27表达及慢病毒介导HSP27过表达，分析HSP27影响BTZ诱导的骨髓瘤细胞凋亡的分子机制。

1 对象与方法

1.1对象 选取2017年1月—2018年5月笔者医院收治的22例MM患者，男性13例，女性9例，年龄中位数62岁(50～75岁)。将12例初治MM患者和10例复发MM患者分为初治组和复发组。MM诊断和临床分期参照2017年中国专家共识标准[7]，入组患者染色体核型分析为正常核型，排除难治性骨髓瘤患者及合并其他肿瘤患者。所有临床检验样本的采集均经受检者知情同意并获得医院伦理学委员会批准。

1.2材料 人MM细胞株U266，NCI-H929和MM1S细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。胎牛血清、DMEM培养液及Opti-MEM培养液(美国Gibco公司)，Lipofectamine 2000及相关转染试剂(美国Invitrogen公司)。兔抗人HSP27，p-HSP27，GRP78，p-PERK，cl-Caspase 3，cl-Caspase 9及内参照β肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(美国Affinity Biosciences公司)。慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro(美国SBI公司)，慢病毒辅助质粒pMD2.G和psPAX2(广州吉赛生物科技股份有限公司)。BTZ(批号：160923533，西安杨森生物制药有限公司)；多柔比星(doxorubicin，DOX)(批号：17013012，江苏恒瑞医药股份有限公司)；依托泊苷(etoposide，Vp-16，批号：1609233，齐鲁制药有限公司)；4-苯基丁酸(批号：E8520，美国Sigma公司)。AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡试剂盒(美国BD公司)；实时荧光定量PCR检测试剂盒(美国Gene Copoeia公司)。所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。TRIzol试剂(美国Life Technologies公司)；反转录试剂及qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒(广州Geneseed公司)。实时荧光定量PCR仪(ABI 7500，美国ABI公司)；流式细胞仪(FACSCantoⅡ，美国BD公司)。

1.3方法

1.3.1原代骨髓瘤细胞收集和染色体分析 骨髓穿刺术抽取MM患者骨髓后通过流式细胞术分选骨髓瘤细胞(CD38+/CD138+浆细胞)，采用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)法检测骨髓瘤细胞中常见染色体异常，由武汉海思特康圣达医学检验中心进行检测，采用5种特异性探针(1q21，D13S319，RB-1，IgH和p53)，同时留存患者的临床资料。

1.3.2siRNA沉默HSP27表达 将U266细胞分为观察组和对照组，分别转染HSP27-siRNA和NC-siRNA。应用在线设计软件(http://www.oligoengine.com)设计针对HSP27基因的siRNA序列：

正义链：5′-AAGACCAAGGAUGGCGUGGUGdTdT-3′

反义链：5′-CACCACGCCAUCCUUGGUCUUdTdT-3′

同时设计一条与HSP27基因无同源性的阴性对照siRNA：

正义链：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGTdTdT-3′

反义链：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3′

U266细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，培养条件为37 ℃恒温、体积分数为0.05的CO2培养箱。每2～3天换液1次，每4～5天传代。取对数生长期的细胞消化后接种至6孔培养板中，待细胞融合度为70%～80%时进行转染，转染前更换为含1%胎牛血清的培养液。分别将5 μL siRNA(20 μmol/L)溶解于200 μL Opti-MEM培养液中，同时取8 μL LipofectAMINE 2000溶解于200 μL Opti-MEM培养液中静置5 min，将两种Opti-MEM培养液混合，静置20 min。最后将siRNA和LipofectAMINE 2000的混合液加入含1.6 mL Opti-MEM培养液的各组细胞中，并置于培养箱中培养6 h，后更换为含10%胎牛血清的完全培养液继续培养48 h。收集细胞，分别采用qRT-PCR和Western-blot验证干扰HSP27基因后细胞中HSP27 mRNA和蛋白的表达情况。

1.3.3慢病毒介导HSP27过表达 采用Pubmed检索获得HSP27基因全长序列(GenBank：AB020027.1)，设计针对HSP27基因全长序列的引物，并在引物两端引入核酸内切酶切位点XbaⅠ和BamHⅠ。HSP27基因引物序列为：

上游：5′-GCTCTAGAATGACCGAGCGCCG-3′

下游：5′-CGCGGATCCTTACTTGGCGG-3′

以人U266细胞cDNA为模板扩增获得HSP27基因全长序列，PCR产物经试剂盒纯化后用XbaⅠ和BamHⅠ进行双酶切(37 ℃，2 h)，慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro同时行双酶切(37 ℃，2 h)，将纯化的PCR产物在T4DNA Ligase连接酶的作用下(25 ℃，30 min)与线性化的慢病毒载体连接，构建获得重组pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro/HSP27慢病毒表达载体。以空载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro作为阴性对照，利用慢病毒辅助质粒pMD2.G和psPAX2包装慢病毒载体，分别获得重组慢病毒pCDH/HSP27和空载体慢病毒pCDH。取对数生长期的U266细胞，分别用慢病毒pCDH/HSP27和pCDH[感染复数(multiplicity of infection，MOI)为300]进行感染；采用2 mg/L的嘌呤霉素(puromycin)进行抗性筛选病毒感染后的细胞，获得稳定表达的细胞系。分别采用qRT-PCR和Western-blot检测感染空载体pCDH(阴性对照组)和重组慢病毒pCDH/HSP27(pCDH/HSP27组)的U266细胞中HSP27 mRNA和蛋白的表达情况。

1.3.4qRT-PCR法检测HSP27 mRNA相对表达水平 采用TRIzol一步法提取细胞中总RNA，测定其浓度，并反转录为cDNA。以此cDNA为模板行PCR扩增，实验流程按照试剂盒说明书进行；反应体系为qPCR SYBR®Green Master Mix 10 μL、上下游引物各10 μmol/L、50×ROX Reference Dye 20.4 μL、cDNA模板2 μL，ddH2O补齐反应体系至20 μL；反应程序为95 ℃预变性5 min→95 ℃变性10 s→60 ℃退火和延伸34 s，共40个循环；95 ℃ 15 s→60 ℃ 60 s和95 ℃ 15 s获取熔解曲线。HSP27基因引物序列为：

上游：5′-CAAGGATGGCGTGGTGGA-3′

下游：5′-TCGAAGGTGACTGGGATGGT-3′

以β-actin为内参照，引物序列为：

上游：5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′

下游：5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′

以2-△△Ct值表示目的基因mRNA的相对表达水平。

1.3.5Western-blot法检测HSP27蛋白表达 提取各实验组细胞(1×106个细胞)，快速放进预冷过的匀浆器中，按1∶10的体积比例加入含PMSF的蛋白裂解液，低温下匀浆后将样品转移至1.5 mL EP离心管中，12 000×g、4 ℃离心10 min，取上清液即为所提取的总蛋白。采用BCA法将蛋白定量后，行SDS-PAGE(分离胶浓度为10%)分离蛋白。随后将蛋白转移至PVDF膜上，用含5%脱脂牛奶的封闭液室温封闭90 min；加入兔抗人HSP27，p-HSP27，GRP78，p-PERK，cl-Caspase 3，cl-Caspase 9和β-actin(内参照)单克隆抗体(体积稀释比例均为1∶5 000)4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次；再加入二抗[辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(体积稀释比例1∶5 000)]，室温孵育120 min，TBST洗涤3次，用化学发光法显影、冲洗胶片。采用Image-Pro Plus 6.0灰度扫描软件对结果进行半定量分析。

1.3.6流式细胞术检测细胞凋亡 收集各实验组细胞，PBS洗涤2次，调整细胞密度为1×106mL-1。取400 μL细胞悬液，加入5 μL AnnexinⅤ-FITC混匀，室温避光孵育10 min，离心去上清，重悬细胞后加入PI，终浓度为1 μg/mL，避光作用后用FACSCantoⅡ流式细胞仪检测细胞凋亡率。

2 结 果

2.1BTZ对骨髓瘤细胞株HSP27 mRNA和蛋白表达的影响 对照组U266细胞加DMEM培养液，观察组DMEM培养液中加入终浓度为2，5，10和20 nmol/L BTZ，8 h后流式细胞仪检测凋亡率，结果显示，对照组细胞凋亡率为(2.94±0.96)%，观察组5 nmol/L BTZ处理8 h细胞凋亡率为(3.23±0.91)%，差别无统计学意义(P>0.05)，以5 nmol/L BTZ为后续研究基线浓度。对照组U266，NCI-H929和MM1S细胞加DMEM培养液，观察组U266，NCI-H929和MM1S细胞DMEM培养液中加入终浓度5 nmol/L BTZ处理8 h。qRT-PCR和Western-blot结果显示，与对照组比较，观察组HSP27 mRNA表达显著增加，HSP27和p-HSP27蛋白表达显著增加(P<0.01，表1)。

表1 硼替佐米对骨髓瘤细胞株HSP27 mRNA和蛋白表达水平的影响

n=5. BTZ：硼替佐米；MM：多发性骨髓瘤. 与对照组细胞比较，☆：P<0.01.

2.2MM患者瘤细胞染色体分析及HSP27 mRNA和蛋白的表达 初治组与复发组患者的Durie-Salmon(DS)分期和International Staging System(ISS)分期比较，差别无统计学意义(P>0.05，表2)。FISH检测结果显示，两组患者骨髓瘤细胞染色体类型和染色体异常数量差别无统计学意义(P>0.05，表2)，复发组患者复发时与初治时比较未检出新的染色体异常，两组患者资料具有可比性。qRT-PCR和Western-blot结果显示，与初治组比较，复发组患者骨髓瘤细胞的HSP27 mRNA表达显著增加，HSP27和p-HSP27蛋白表达显著增加(P<0.01，图1)。

2.3沉默HSP27表达对BTZ诱导U266细胞凋亡的影响 对照组与观察组U266细胞分别转染NC-siRNA和HSP27-siRNA，48 h后观察组HSP27基因的mRNA和蛋白表达水平分别为对照组的28.61%和34.33%(P<0.01)。对照组和观察组细胞凋亡率分别为(3.42±1.16)%和(3.98±1.06)%，差别无统计学意义(P>0.05，图2)。将对照组和观察组U266细胞分别暴露于终浓度5 nmol/L BTZ 24 h，两组细胞的凋亡率分别为(7.68±1.19)%和(14.56±2.58)%；进一步增加BTZ浓度，BTZ终浓度为10 nmol/L时，两组的凋亡率分别为(16.11±5.15)%和(23.32±5.13)%；BTZ终浓度为20 nmol/L时，两组的凋亡率分别为(25.44±5.81)%和(38.09±7.87)%；观察组的凋亡率均显著高于对照组(P<0.01，图2)。

2.4BTZ对U266细胞内质网应激及凋亡相关蛋白表达的影响 对照组U266细胞加DMEM培养液，观察组DMEM培养液中加入终浓度为5，10和20 nmol/L BTZ作用8 h。Western-blot结果显示，随着BTZ浓度增加，GRP78和p-PERK表达递增，cl-Caspase 3和cl-Caspase 9表达显著升高(P<0.05，图3)。

表2初治与复发骨髓瘤患者临床分期及染色体FISH分析比较

Tab 2Comparison of clinical stages and chromosomal abnormalities between newly treated and relapsed myeloma patients

项 目n初治组(%)n复发组(%)χ2PDS分期0.040.84 Ⅲ期A10(83.3)8(80.0) Ⅲ期B2(16.7)2(20.0)ISS分期0.040.84 Ⅰ期2(16.7)2(20.0) Ⅱ期4(33.3)3(30.0) Ⅲ期6(50.0)5(50.0)染色体类型 正常4(33.3)3(30.0)0.570.45 lq21扩增5(41.7)5(50.0)0.150.70 IgH重排5(41.7)4(40.0)0.630.43 Rb1缺失6(50.0)5(50.0)0.730.39 D13S319 缺失7(58.3)4(40.0)2.930.09 p53 缺失2(16.7)3(30.0)0.080.78染色体异常数量0.020.87 0种4(33.3)3(30.0) 1种1(8.3)1(10.0) 2种1(8.3)1(10.0) 3种 3(25.0)3(30.0) 4种 2(16.7)1(10.0) 5种1(8.3)1(10.0)

DS：Durie-Salmon；ISS：International Staging System；FISH：荧光原位杂交.

A：qRT-PCR检测MM患者骨髓瘤细胞；B，C，D：Western-blot检测MM患者骨髓瘤细胞. A组：初治MM患者； B组：复发MM患者. BTZ：硼替佐米；MM：多发性骨髓瘤. 与A组比较，☆：P<0.01.图1 MM患者骨髓瘤细胞HSP27 mRNA，HSP-27和p-HSP27蛋白相对表达量Fig 1 The relative expression of HSP27 mRNA，HSP-27 and p-HSP27 protein in the myeloma cells of MM patients

BTZ：硼替佐米. 与NC-siRNA组比较，☆：P<0.01.图2 沉默HSP27表达对硼替佐米诱导U266细胞凋亡的影响Fig 2 Effect of silencing HSP27 expression on the apoptosis of U266 cells induced by BTZ

2.54-苯基丁酸对BTZ诱导U266细胞Caspase-3和Caspase-9活化的影响 对照组U266细胞以DMEM培养液预处理，观察组以1 mmol/L 4-PBA预处理2 h。两组细胞以20 nmol/L BTZ作用8 h。Western-blot结果显示，与对照组比较，观察组U266细胞cl-Caspase 3和cl-Caspase 9表达显著下调(P<0.01，图4)。

2.6HSP27过表达对BTZ诱导U266细胞GRP78蛋白表达和Caspase-3活化影响 根据以上结果，推测HSP27通过降低内质网应激影响BTZ诱导的骨髓瘤细胞凋亡。对照组U266细胞感染空载体慢病毒pCDH，观察组U266细胞感染重组慢病毒pCDH/HSP27，48 h后观察组HSP27 mRNA和蛋白表达水平分别为对照组的8.27和2.58倍(P<0.01)。两组细胞以20 nmol/L BTZ作用8 h。Western-blot结果显示，与对照组比较，观察组U266细胞GRP78表达显著下调，伴cl-Caspase 3表达显著下调(P<0.01，图5)。

BTZ：硼替佐米. 与NC组比较，☆：P<0.05.图3 硼替佐米对U266细胞内质网应激及凋亡相关蛋白表达的影响Fig 3 Effects of bortezomib exposure on expression of endoplasmic reticulum stress and apoptosis related proteins in U266 cells

4-PBA：4-苯基丁酸. 与NC组比较，☆：P<0.01.图4 4-苯基丁酸对硼替佐米诱导U266细胞Caspase-3和Caspase-9活化的影响Fig 4 Effect of 4-PBA on activation of Caspase-3 and Caspase-9 induced by bortezomib in U266 cells

与NC组比较，☆：P<0.01.图5 HSP27过表达对硼替佐米诱导U266细胞GRP78蛋白表达和Caspase-3活化的影响Fig 5 Effect of HSP27 overexpression on expression of GRP78 and activation of Caspase-3 induced by bortezomib in U266 cells

3 讨 论

BTZ是26S蛋白酶体糜蛋白酶样活性的可逆抑制剂，靶向作用于泛素-蛋白酶体系统(ubiquitinproteasome system，UPS)，抑制核因子NF-κB活性，发挥抗骨髓瘤作用[14]。骨髓瘤对BTZ耐药的机制较复杂，目前认为与NF-κB信号通路异常、Bcl-2家族蛋白高表达、药物诱导凋亡途径异常、浆细胞去分化等有关，几种不同机制可能同时参与耐药[15]。本研究结果显示，BTZ暴露引起骨髓瘤细胞热休克反应，显著上调HSP27的表达和磷酸化；更为重要的是，siRNA沉默HSP27表达，显著增加BTZ诱导的骨髓瘤细胞凋亡。本研究结果提示，HSP27通过负反馈机制介导骨髓瘤细胞对BTZ耐药，有望成为骨髓瘤治疗的新靶点。

本研究采用CD138+免疫磁珠分选MM患者浆细胞，获得高度富集的骨髓瘤细胞，检测其HSP27表达水平，结果显示，复发骨髓瘤患者HSP27表达水平显著高于初治患者，提示HSP27可作为骨髓瘤耐药的预测因子及评估预后的参考指标。体外研究发现，BTZ耐药骨髓瘤细胞株NCI-H929的HSP27表达显著上调[16]，抑制HSP27磷酸化显著增加BTZ诱导的骨髓瘤细胞凋亡[17]，本研究结果与其相仿。Chauhan等对地塞米松耐药的骨髓瘤细胞进行寡核苷酸微阵列芯片分析，发现HSP27在耐药骨髓瘤细胞中高表达，影响肌动蛋白聚合和细胞骨架重排，沉默HSP27表达显著增强了甲氧雌二醇和BTZ诱导的凋亡[18]。以上研究结果均提示HSP27参与骨髓瘤细胞耐药，具体机制不明。

近年来，内质网应激介导的凋亡逐渐引起人们关注。研究发现，MM细胞内质网应激显著增强[19]。一方面，内质网应激激活未折叠蛋白反应，缓解内质网压力，维持细胞生存[20]；另一方面，过度或持续的内质网应激，超过细胞自身的调节能力，诱导骨髓瘤细胞凋亡[21]。本研究结果显示，BTZ暴露显著上调U266细胞GRP78和p-PERK的表达，增强Caspase-3和Caspase-9的活化，表明BTZ暴露增强内质网应激，通过Caspase途径诱导骨髓瘤细胞凋亡。进一步反证，U266细胞用内质网应激抑制剂预处理后，显著减弱了BTZ暴露对Caspase-3和Caspase-9的活化，证实了这一猜想。分析其原因，可能与BTZ抑制了蛋白酶体活性，降低了未折叠及错误折叠蛋白的泛素化降解，进一步增强了内质网应激有关[22]。

在应激条件下，HSP27作为分子伴侣，协助蛋白质折叠、诱导错误折叠的蛋白质降解，提示其具有调节内质网应激，增强肿瘤细胞应激耐受性的巨大潜能。本研究结果显示，用慢病毒介导U266细胞过表达HSP27后，BTZ暴露诱导的GRP78表达显著降低，Caspase-3活化减弱，表明HSP27表达上调抑制BTZ诱导的内质网应激，减少Caspase依赖的骨髓瘤细胞凋亡。Lamoureux等研究发现，靶向HSP27的反义寡核苷酸(OGX-427)可以诱导内质网应激，增强HSP90抑制剂17-AAG诱导的小鼠膀胱癌细胞凋亡[23]。Rocchi等研究发现，前列腺癌细胞中HSP27表达上调可以抑制STAT3信号通路活化及其下游基因c-fos和sPLA-2的表达，阻断STAT3信号通路显著削弱HSP27的细胞保护作用[24]。值得注意的是，STAT3信号通路是调节内质网应激的重要信号通路之一，与肿瘤耐药密切相关[25]。本研究结论与这些研究结果一致。此外，有研究发现，内质网应激可以调节HSP27的磷酸化与聚合，从而影响其生物学功能，两者间依生物学背景而变化的联系还有待进一步研究阐明。

本研究发现BTZ通过内质网应激途径诱导骨髓瘤细胞凋亡，并上调HSP27表达，HSP27负反馈抑制内质网应激，介导骨髓瘤耐药。本研究的不足之处是未分析HSP27表达对骨髓瘤患者接受BTZ治疗的疗效和预后的影响，这是后续研究的内容之一。