mTORC2通路调控CD4+CD25highTreg在糖尿病肾病大鼠中的研究

曾 艳， 赵 青， 周 静， 李秋月

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)的发病机制涉及遗传和血流动力学、高血糖、糖基化、氧化应激、脂质介质和细胞因子信号等方面。最近，T细胞被提出参与了2型DN的发生发展[1]。在2型糖尿病合并微血管病变时，患者的Treg细胞比例明显下降[2]。mTOR阻断剂能干扰生长因子、细胞因子等生物活性物质的分泌，调节Treg细胞的增殖[3]。mTOR有两种复合体：Raptor-mTOR(mTORC1)和Rictor-mTOR(mTORC2)，FK506目前被认为是mTORC1阻断剂，而ku0063794是mTORC1和mTORC2的双重阻断剂。本研究通过观察两种mTOR通路阻断剂对DN大鼠CD4+CD25highTreg的影响，探讨Treg在DN中的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1动物 健康雄性SD大鼠40只，体质量(250±25)g，清洁级(南昌大学医学院动物科学部)，许可证号：SYXK(赣)2010-0002。

1.1.2试剂 脲佐菌素(streptozotocin，STZ，北京博爱港公司)，FK506(杭州中美华东公司)，ku0063794(美国Selleck公司)，mTOR抗体(美国Bioworld公司)，Raptor抗体(武汉三鹰生物技术有限公司)，Rictor抗体(美国CST公司)，抗CD4-FITC单抗和抗CD25-PE单抗(美国eBioscience公司)，IL-17和TGF-β1 Elisa 试剂盒(深圳欣博盛生物公司)。

1.2方法

1.2.1模型建立和分组 40只SD雄性大鼠，随机选取10只作为A组(对照组)，30只腹腔注射STZ，剂量为55 mg/Kg，以随机血糖值≥16.7 mmol/L 且稳定5 d为DN造模成功。分为：B组(模型组)、C组(FK506干预组)、D组(ku0063794干预组)。C，D组分别予FK506 1 mg·kg-1·d-1及ku0063794 1 mg·kg-1·d-1灌胃；A，B组予以等量生理盐水灌胃。

1.2.2mTOR，Raptor，Rictor蛋白半定量检测 采用Western-blot法检测，以β-actin为内参。4，8周时，各组随机选取一半大鼠，开腹游离并取出肾脏，取肾皮质加适量裂解液后匀浆，测定蛋白浓度后，各样品取50 μg总蛋白上样电泳，转入PVDF膜，用5%脱脂牛奶室温摇床封闭2 h。分别加入封闭液稀释的一抗：兔抗raptor按1∶2 000稀释，兔抗rictor按1∶1 000稀释，兔抗mTOR按1∶800稀释。4 ℃过夜。TBST洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5 000)，室温孵育后，ECL显影、曝光，用凝胶成像分析系统成像，扫描灰度值，进行半定量分析。

1.2.3肾脏病理检查 8周时取肾组织，石蜡切片脱蜡水化后行苏木精-伊红染色法 ( hematoxylin-eosin staining，H-E)、过碘酸六胺银染色(periodic acid-silver metheramine, PASM)染色，光学显微镜下观察肾组织病理改变并拍照，用BI2000图像系统分析，进行肾脏病理评分[4]。

1.2.3.1肾小球病理评分

1.2.3.1.1系膜细胞增殖 按无、轻、中、重度增殖分别记0，1，2，3分。

1.2.3.1.2基质增宽 正常记0分；轻度变化毛细血管袢无明显影响记1分；中度变化呈弥漫性增宽，50%以下毛细血管袢狭窄闭锁记2分；重度变化呈弥漫性增宽，50%以上毛细血管袢狭窄闭锁记3分。

在知识经济背景下，人力资源已经成为企业发展的核心。目前，我国通信行业还处于初级的发展水平，因而在诸多方面还不是十分的完善。其中，人力资源管理中，薪酬分配制度缺乏合理性就是重要的体现。现阶段，我国大部分通信公司在薪酬分配过程中，采用的分配体系都是依托岗位技能为主的等级薪酬制。显然，这种传统的薪酬分配制度难以满足员工的需求。因此，通信行业人力资源管理中薪酬分配制度必须要不断完善。

1.2.3.1.3硬化改变 正常记0分；局灶节段分布，硬化肾小球<30%记1分；30%～60%记2分；>60%记3分。

1.2.3.1.4新月体形成 正常记0分；局灶节段分布<25%记1分；弥漫性节段分布30%～50%记2分；弥漫灶状分布>50%记3分。

1.2.3.2肾小管间质病理评分

1.2.3.2.1肾小管变性、坏死 按无、轻、中、重度受损分别记0，1，2，3分。

1.2.3.2.2肾小管萎缩 按无、小灶状、片灶状、弥漫性重度分别记0，1，2，3分。

1.2.3.2.3间质炎症细胞浸润 按无、小灶状、片灶状、弥漫性重度分别记0，1，2，3分。

1.2.3.2.4间质纤维化 按无、小灶状、片灶状、弥漫性重度分别记0，1，2，3分。

1.2.3.3病理总评分 病理总评分=肾小球评分+肾小管评分，总分最多为24分。

1.2.4血IL-17及TGF-β1检测 酶标包被板，设置空白孔、标准孔、待测样本孔；空白孔加样品稀释液100 μL、标准孔加标准品100 μL、待测样本孔加待测样品100 μL；37 ℃覆膜孵育90 min；弃去孔内液体，甩干，洗板5次；每孔加HRP Conjugate工作液100 μL，37 ℃覆膜温育30 min；甩干，洗板5次，每孔加底物溶液90 μL，37 ℃覆膜避光孵育15 min，加终止液50 μL终止反应；用450 nm波长测量各孔的吸光值(OD值)，根据标准品浓度及其对应的OD值，计算标准曲线直线回归方程，再根据样本OD值，用回归方程计得出对应的样品浓度，最终浓度用实际测定浓度与稀释倍数相乘。

1.2.5血CD4+CD25highTreg百分比检测 血液加等量PBS液使之充分混匀后，加入淋巴分离液，离心后毛细吸管吸取上中层界面处的细胞，再次加入PBS液，离心后取管底细胞，重复2次，调整单个核细胞浓度至(1～2)×105L-1。抗CD4-FITC单抗和抗CD25-PE单抗各1 μL分别加入试管，鼠IgG2a、鼠IgG1各1 μL分别加入同型对照管，混匀避光孵育30 min，PBS洗涤离心后弃上清液，采用美国BDFACSCalibur型流式细胞仪检测血CD4+CD25highTreg的百分比。

2 结 果

2.1肾组织的mTOR，Raptor，Rictor蛋白水平检测 4，8周时，B组的mTOR较A组明显升高(P<0.05)，C组干预4周后下降，低于B组(P<0.05)；8周时C，D组均明显低于B组(P<0.001)，C，D组间比较差别无统计学意义(P>0.05)；4，8周时，B组的Raptor较A组明显升高(P<0.05)，C，D组均低于B组(P<0.05)，C，D组间比较差别无统计学意义(P>0.05)；4，8周时 B组Rictor较A组明显升高(P<0.05)，4周时C，D组下降低于B组(P<0.05)，8周时进一步下降，与A组比较，差别有统计学意义(P>0.05)，C，D组间比较差别无统计学意义(P>0.05，图1)。

2.2血CD4+CD25highTreg百分比检测 4，8周时，B组CD4+CD25highTreg明显低于A组(P<0.05)，C，D组干预4周后CD4+CD25highTreg逐步回升，高于B组(P<0.05)；8周时进一步升高，均高于4周时(P<0.05)；C，D组间比较差别无统计学意义(P>0.05，图2，3)。

2.3血TGF-β1和IL-17检测 4，8周时，B组TGF-β1明显高于A组(P<0.05)，干预后指标下降，C组低于D组(P<0.05)；4，8周时，B组IL-17明显高于A组(P<0.05)，干预后指标下降，C，D组均低于B组(P<0.05，图4)。

2.4病理评分 光镜下B组大鼠系膜细胞及基质弥漫增生，部分毛细血管扩张，呈分叶状，基底膜增厚，部分肾小管上皮肿胀，肾小管萎缩，间质炎性细胞浸润，部分纤维化。B，C，D组大鼠病理评分均高于A组(P<0.05)，C，D组病理评分低于B组(P<0.05)；C，D组间比较，差别无统计学意义(P>0.05，图5，6)。

A：对照组；B：模型组；C：FK506干预组；D：ku0063794干预组. 与A组同时间点比较，○：P<0.05；与B组同时间点比较，●：P<0.05.图1 DN大鼠肾组织mTOR, Raptor及Rictor蛋白的表达Fig 1 Expression of mTOR, Raptor and Rictor proteins in diabetic nephropathy rats

A：对照组；B：模型组；C：FK506干预组；D：ku0063794干预组. 与A组同时间点比较，○：P<0.05；与B组同时间点比较，●：P<0.05；与B组0周比较，△：P<0.05；与D组4周比较，▲：P<0.05；与C组4周比较，☆：P<0.05.图2 DN大鼠CD4+CD25high TregFig 2 CD4+CD25high Treg in diabetic nephropathy rats

2.5相关性分析 8周时，B组大鼠的Rictor与CD4+CD25highTreg及Ccr呈负相关(P<0.05)，与TGF-β1，IL-17及尿蛋白、病理评分呈正相关(P<0.05)；Raptor与尿蛋白和病理评分呈正相关(P<0.05)，与Ccr呈负相关(P<0.05)，与CD4+CD25highTreg，TGF-β1及IL-17均无相关性(P>0.05)。

3 讨 论

在肾小球疾病，短期的mTOR通路的激活是有积极影响的，但是长时间激活导致蛋白尿和肾小球硬化。在非常早期的DN中，mTORC1靶基因的表达增加[5]，下调足细胞mTORC1表达能阻止肾小球硬化，在足细胞病大鼠中敲除Raptor会很快导致蛋白尿、肾小球硬化的发展、足突的融合和消失[6]，而敲除Rictor短期内足细胞无明显变化；但若同时敲除Raptor和Rictor会导致大鼠肾功能迅速衰减甚至死亡，由此推测在糖尿病足细胞病中mTORC1和mTORC2两条通路都起重要作用。笔者的前期研究已发现，Rictor与DN大鼠足细胞Ezrin及α-SMA蛋白的表达相关[7]。本研究中，分别给予FK506和ku0063794两种mTOR阻断剂，FK506组起效比ku0063794组快，在4周时即下调了mTOR的表达；两干预组对Rictor蛋白的调控均有效，且有时效性，8周时较4周时下降更明显，两组间差别无统计学意义，提示FK506也有可能通过延长作用时间阻断Rictor-mTOR通路。

mTOR通路阻断剂能显著增强肾脏Treg细胞的扩张，提升Treg细胞和巨噬细胞的数量，增加抗炎细胞因子的表达，抑制常规T细胞、骨髓细胞、肌成纤维细胞，改善肾功能和减少肾脏纤维化[8]。本研究中，FK506和ku0063794干预组均可增加CD4+CD25+Treg细胞的数量，给药时间长也使效果更明显。CD4+CD25+Treg细胞可分泌IL-4，IL-7及TGF-β等多种细胞因子，TGF-β参与足细胞向间质细胞转分化，加重细胞外基质的沉积，促进足细胞凋亡，肾脏以TGF-β1表达最多且活性最高[9]，TGF-β1在DN早期可降低血糖、减轻肾脏肥大、减轻氧化应激、维持STAT3活化，致Treg/Th17平衡，在改善代谢紊乱和延缓DN肾脏损伤方面有保护作用[10]，但TGF-β1表达过度会加重肾脏损伤。Treg细胞通过分泌TGF-β促进Th17细胞发育、成熟，Th17是促炎性细胞，可分泌TNF-α，IL-6及IL-17等参与炎症反应[11]，进一步放大体内炎症效应，是自身免疫性疾病的致病效应性细胞。尤其是IL-17，它能抑制足细胞Podocalyxin的表达，导致肾小球基底膜的电荷屏障受损，促进大量蛋白尿的形成[12]，还可以促进足细胞凋亡，这一作用且呈浓度、时间依赖性。

DN：糖尿病肾病. A：空白对照组；B：模型组；C：FK506干预组；D：ku0063794干预组.图3 DN大鼠CD4+CD25high Treg在各时间点的变化Fig 3 Changes of CD4+CD25high Treg in DN rats at various time points

DN：糖尿病肾病; TGF:肿瘤生长因子. A：对照组；B：模型组；C：FK506干预组；D：ku0063794干预组. 与A组同时间点比较，○：P<0.05；与B组同时间点比较，●：P<0.05；与C组同时间点比较，△：P<0.05；与D组4周比较，▲：P<0.05.图4 DN大鼠TGF-β1和IL-17检测结果Fig 4 TGF-β1 and IL-17 in DN rats

DN：糖尿病肾病. A：对照组；B：模型组；C：FK506干预组；D：ku0063794干预组. 与A组同时间点比较，○：P<0.05；与B组同时间点比较，●：P<0.05.图5 DN大鼠肾脏病理评分Fig 5 Kidney pathology score in DN rats

DN：糖尿病肾病. A：对照组；B：模型组；C：FK506干预组；D：ku0063794干预组.图6 8周时DN大鼠肾组织病理(PASM染色 ×400)Fig 6 Renal tissue pathology of DN rats at 8 weeks (PASM staining ×400)

本研究中，模型组大鼠的TGF-β1高表达，给予mTOR阻断剂后表达下调，提示mTOR通路阻断剂可能通过减少CD4+CD25+Treg细胞，下调TGF-β等多种细胞因子，从而减少Th17细胞分泌IL-17等炎症因子，减轻肾脏损伤。Rictor与CD4+CD25+Treg呈负相关，与TGF-β和IL-17呈正相关；Raptor与CD4+CD25+Treg，TGF-β和IL-17均无相关性，提示CD4+CD25+Treg可能受Rictor-mTOR通路调控。后续将运用体外试验进一步证实Treg/Th17平衡受Rictor-mTOR通路调控，为DN的治疗提供新的靶点。