miR-7靶向Sp3对急性胰腺炎腺泡细胞增殖和凋亡的影响及机制研究

熊 凯, 陈 建, 傅庆洋

熊凯, 傅庆洋, 义乌市中心医院急诊科 浙江省义乌市 322000

陈建, 义乌市中心医院胃肠外科 浙江省义乌市 322000

核心提要： miR-7在雨蛙素构建的急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)模型细胞中高表达, miR-7靶向负调控特异性蛋白3(specific protein 3, Sp3), 敲减miR-7表达可以通过上调Sp3抑制AP腺泡细胞凋亡.

0 引言

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是临床上常见的一种急腹症, 其发病率呈逐年上升趋势, 死亡率也一直较高[1].AP的致病因素很多, 发病机制尚未完全清楚, 有研究发现腺泡细胞凋亡和AP的严重程度呈负相关, 可以通过促进腺泡细胞的凋亡减轻AP的严重程度[2]. 抑制GRP78可以促进胰腺腺泡细胞凋亡, 减轻雨蛙素诱导的胰腺炎症的严重程度[3]. miR-7是miRNA家族的成员之一, 不仅参与多种组织器官的发育, 且与临床相关疾病的发生发展密切相关[4]. miR-7在胃炎组织中miR-7低表达, 下调其表达可促进细胞增殖, 引起炎症促使癌症发生[5]. 上调miR-7的表达能抑制人胰腺癌AsPC-1和BxPC-3细胞增殖和侵袭能力, 促进细胞凋亡[6]. miR-7在小鼠急性肺损伤模型中上调表达, 通过调控KLF4可以改善急性肺损伤[7]. miR-7在肾癌组织中高表达, 可作为肾癌早期诊断、治疗乃至预后判断的新的生物标记物[8]. mmiR-7在口腔鳞状细胞癌中低表达, 与上皮间质转化过程高度相关[9]. 此外miRNA也与AP的诊断和预后相关[10]. 研究发现miR-494在AP条件下表达升高, 可以抑制胰腺腺泡细胞凋亡[11]. miR-216a在AP中高表达, 可作为生物标记物用来早期诊断[12]. 而miR-7在AP中的研究较少, 基于此,本实验旨在研究miR-7对AP腺泡细胞增殖和凋亡的影响及相关机制, 为AP的早期诊断、治疗和预后提供新靶点和临床依据.

1 材料和方法

1.1 材料 大鼠胰腺腺泡AR42J购自中国科学院上海细胞库. 雨蛙素购自美国Sigma公司; 胎牛血清、RPMI 1640培养基均购自美国Gibco公司; RNA提取试剂盒、反转录试剂盒和qPCR试剂盒购自日本Takara公司; 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒购自上海联科生物技术有限公司; Western Blot试剂盒购自上海信裕生物技术有限公司; BCA试剂盒、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和碘化丙锭(PI)试剂盒购自碧云天生物技术研究所; LipofectamineTM2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司; 双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司; 细胞板、流式细胞仪购自赛默飞公司; 载体质粒均由金瑞斯生物科技公司构建.

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及AP建模: 大鼠胰腺腺泡AR42J细胞常规培养于含10% FBS的RPMI 1640培养基, 置于37 ℃,含5%CO2恒温箱培养. 每2-3 d传代一次. 造模前一天取AR42J细胞接种于6孔板上, 培养24 h后加入15 nmol/L的雨蛙素, 震荡混匀后继续培养, 取0 h、4 h、8 h、12 h、24 h时间点的细胞, 收集备用.

1.2.2 细胞分组和转染: 取常规培养的大鼠胰腺腺泡AR42J细胞消化后接种于96孔板中, 待细胞生长至80%融合进行相关实验, 分为NC组、Cerulein组(添加15 nmol/L雨蛙素)、miR-con组(转染miR-con)、miR-7组(转染miR-7 mimics)、anti-miR-con组(转染anti-miR-con组)、anti-miR-7组(转染anti-miR-7).

取造模成功的AR42J细胞消化后接种于96孔板中,待细胞生长至80%融合, 更换为无血清培养基同步化12 h, 随后进行转染. 转染分为转染分为Cerulein+antimiR-con组(转染anti-miR-con)、Cerulein+anti-miR-7组(转染anti-miR-7)、Cerulein+pcDNA(转染pcDNA)、Cerulein+pcDNA-特异性蛋白3(specific protein 3, Sp3)组(转染pcDNA-Sp3 mimics)、anti-miR-7+si-con组(共转染anti-miR-7和si-con)、anti-miR-7+si-Sp3(共转染antimiR-7和si-Sp3)组, 转染按照LipofectamineTM2000试剂盒进行操作.

1.2.3 ELISA法检测淀粉酶(amylase, AMY)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)的表达: 取雨蛙素处理后各个时间点的细胞, 离心取上清, 按ELISA试剂盒说明书进行检测.

1.2.4 qRT-PCR分析miR-7和Sp3 mRNA表达水平: 按照Trizol说明书提取总RNA, 用反转录试剂盒逆转录成cDNA, 按照AceQ qPCR SYBR®Green Mix说明书进行qRT-PCR方法扩增. 循环条件为95 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s;72 ℃ 30 s, 共40个循环; 60 ℃延长5 min. 相对表达量采用2-△△Ct法计算.

1.2.5 Western Blot检测Sp3蛋白表达: 提取各组细胞蛋白, 用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量. 各组蛋白上样量60 μg, SDS-PAGE后, 经电转将蛋白转移至PVDF膜上. 用5%脱脂牛奶室温封闭90 min, 分别加入相应的一抗, 4 ℃孵育过夜, PBS洗涤3次, 每次5 min; 再加入相对应的二抗室温孵育2 h, PBS洗涤3次, 每次10 min, 后在暗室中曝光显影, 再浸入定影, 最后洗去残液晾干, 将胶片用Quantity One凝胶分析软件处理, 测定各组蛋白条带的吸光度, 以目的条带和β-actin条带的比值作为蛋白表达水平.

1.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡: 用不含EDTA的胰酶消化细胞, 离心收集各组细胞, PBS漂洗2次, 加结合缓冲液重悬细胞. 依据试剂盒说明书, 先后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育. 流式细胞仪检测激发波长488 nm和发射波长530 nm处的荧光强度. 实验重复3次.

1.2.7 荧光素酶报告基因检测实验检测miR-7对Sp3的靶向调控: TargetScan数据库显示Sp3 3′UTR区域有miR-7结合位点. 构建野生型和突变型基因靶点Sp3的3′UTR-荧光素酶表达载体(WT-Sp3和MUT-Sp3), 取对数生长期大鼠胰腺腺泡AR42J细胞接种于24孔板(5×104个/孔),待细胞生长至80%融合时, 用LipofectamineTM2000将WT-Sp3和MUT-Sp3组细胞分别转染miR-con和miR-7.依据说明书要求, 使用荧光素酶报告基因检测仪进行双荧光素酶报告实验测定. 实验结果以荧光素酶活性和Renilla活性的比值进行统计学分析. 实验重复3次.

统计学处理采用SPSS 20.00进行统计学分析. 计量资料以mean±SD表示, 两组比较行t检验, 多组间比较采用单因素方差分析, 以P＜0.01表示差异有统计学意义.

2 结果

2.1 检测雨蛙素处理AMY, TNF-α和IL-6的表达 酶联免疫吸附(ELISA)法检测结果(图1)显示, 与0 h相比, 雨蛙素处理4 h、8 h、12 h、24 h后AMY、TNF-α、IL-6的表达均呈现先升高后下降的趋势, 且均在8 h时达到最大.

2.2 雨蛙素处理AR42J后miR-7和Sp3的表达 qRT-PCR检测结果(图2A和B)显示, 雨蛙素处理AR42J后miR-7的表达水平显著升高, Sp3 mRNA的表达水平显著下降(P＜0.01). Western Blot检测结果(图2C和D)显示, 与对照组相比, 雨蛙素处理后Sp3蛋白的表达水平显著下降(P＜0.01). 可见, 雨蛙素处理AR42J促进miR-7的表达, 抑制Sp3的表达.

2.3 敲减miR-7对雨蛙素处理AR42J细胞凋亡的影响qRT-PCR检测结果(图3A)显示, 雨蛙素处理AR42J后miR-7的表达水平显著升高, 相较于Cerulein+anti-miR-con组, Cerulein+anti-miR-7组miR-7的表达水平显著下降(P＜0.05). 流式细胞仪检测结果(图3B)显示, 雨蛙素处理AR42J后细胞凋亡率显著升高, Cerulein+anti-miR-7组于Cerulein+anti-miR-con组, AR42J细胞的凋亡率显著降低(P＜0.01). 可见, 敲减miR-7可以抑制雨蛙素处理AR42J细胞凋亡.

2.4 miR-7靶向Sp3 通过TargetScan数据库预测到Sp3与miR-7存在结合位点(图4A). 荧光素酶报告基因检测实验结果(图4B)显示, 转染野生型Sp3基因表达载体WTSp3后, 相较于miR-con组, miR-7组AR42J细胞的荧光素酶活性显著降低(P＜0.01); 而转染突变型Sp3基因表达载体MUT-Sp3后, 相较于miR-con组, miR-7组AR42J细胞的荧光素酶活性差异不显著. Western Blot检测结果(图4C)显示, 相较于miR-con组, miR-7组AR42J细胞中Sp3蛋白的表达水平显著降低; 而相较于anti-miR-con组,anti-miR-7组AR42J细胞中Sp3蛋白的表达水平显著升高(P＜0.01). 可见, miR-7可以靶向调控Sp3.

2.5 过表达Sp3抑制雨蛙素处理AR42J细胞凋亡 Western Blot检测结果(图5A)显示, 相较于NC组, Cerulein组AR42J细胞中Sp3蛋白的表达水平显著降低; 相较于Cerulein+pcDNA组, Cerulein+pcDNA-Sp3组AR42J细胞中Sp3蛋白的表达水平显著升高(P ＜0.01). 流式细胞仪检测结果(图5B)显示, 相较于NC组, Cerulein组AR42J细胞凋亡率显著升高; 相较于Cerulein+pcDNA组, Cerulein+pcDNA-Sp3组AR42J细胞凋亡率显著降低(P＜0.01). 可见, 过表达Sp3抑制雨蛙素处理AR42J细胞凋亡.

2.6 抑制Sp3表达逆转敲减miR-7对雨蛙素处理AR42J细胞凋亡的影响 Western Blot检测结果(图6A)显示, 雨蛙素处理AR42J细胞后, 相较于anti-miR-con组, anti-miR-7组AR42J细胞中Sp3蛋白的表达水平显著升高; 相较于antimiR-7+si-con组, anti-miR-7+si-Sp3组AR42J细胞中Sp3蛋白的表达水平显著降低(P＜0.01). 流式细胞仪检测结果(图6B)显示, 相较于anti-miR-con组, anti-miR-7组AR42J细胞凋亡率显著降低; 相较于anti-miR-7+si-con组, antimiR-7+si-Sp3组AR42J细胞凋亡率显著升高(P＜0.01).可见, 抑制Sp3表达可以逆转敲减miR-7对雨蛙素处理AR42J细胞的抑制凋亡作用.

3 讨论

AP是胰腺的急性炎症性病变, 可分为轻症、中度重症和重症三类, 越严重预后效果越差, 死亡率越高, 严重影响人类身体和生命健康[13]. 重症AP常伴有休克、腹膜炎、败血症、肠道功能障碍、凝血功能异常、全身炎症反应综合征和多器官功能衰竭, 还会并发糖尿病等[14]. 近年来研究发现miRNA在AP中扮演着重要的角色, 参与AP的发生发展[15]. 如miR-9在AP中高表达[16]; 在急性水肿性胰腺炎中上调miR-92b表达, 胰腺腺泡细胞的凋亡率增加[17]; 下调miR-383的表达可以提高AP时细胞自噬水平[18]; miR-21在AP腺泡细胞中低表达, 抑制其表达可抑制雨蛙素诱导的细胞凋亡, 进而加重胰腺炎的发展[19]. 而miR-7在AP病人中高表达, 可作为AP病变的诊断和预后生物标志物[20]. 本研究结果显示, 在雨蛙素处理后的AR42J细胞中miR-7的表达水平显著升高, 而敲减miR-7抑制雨蛙素处理的AR42J细胞凋亡.

图1 雨蛙素处理AR42J后AMY、TNF-α和IL-6表达的影响.

图2 雨蛙素处理AR42J细胞后miR-7和Sp3的表达.

图3 敲减miR-7抑制雨蛙素处理AR42J细胞诱导细胞凋亡.

图4 miR-7靶向调控Sp3的表达.

Sp3是Sp蛋白家族中的一员, 多数情况下是转录抑制因子[21]. 研究发现Sp3通过调控其下游增殖相关的基因的表达调控肿瘤的增殖和凋亡[22]. 转录因子Sp3在肝癌[23]、胰腺癌[24]中高表达, 与肿瘤恶性程度和患者术后复发率相关. Sp3可以增强胃癌细胞的增殖、凋亡、迁移及侵袭能力[25]. Sp3在乳腺癌中高表达, 参与其发生发展及复发转移过程[26]. Sp3可以抑制白血病细胞增殖、促进其凋亡及增强化疗药物的耐药性[27]. miR-223通过靶向调控Sp3可促进ATP结合盒转运蛋白A1表达进而增强细胞胆固醇流出[28]. 而Sp3关于在胰腺炎中的作用极其机制的研究较少, 付强等[29]发现Sp3通过被miR-135a抑制其表达而促进大鼠AP中AR42J细胞的凋亡. 本研究的结果显示, 雨蛙素处理AR42J后Sp3的表达水平显著下降, 过表达Sp3可以抑制雨蛙素处理AR42J细胞凋亡.miR-7靶向负调控Sp3, 抑制Sp3表达可以逆转敲减miR-7对雨蛙素处理AR42J细胞的抑制凋亡作用.

总之, miR-7可通过靶向调控SP3影响AP腺泡细胞的凋亡. 研究miR-7在AP发病机制中的作用及临床价值,为诊断和治疗AP提供新靶点和新思路.

文章亮点

实验背景

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)病因较多且机制较为复杂, 并发症较多, 根据其严重程度主要分为轻型AP和重症AP. 轻型经治疗后恢复较好, 但重症AP早期症状不典型, 且发展迅速, 后期恶化严重可导致多器官功能衰竭, 致死率高. 早诊断重症AP, 及时治疗, 提高治愈率是现阶段临床工作的重点. 我国目前AP主要病因胆道疾病, 高脂血症, 过度酒精, 暴饮暴食等. 治疗方式有内科治疗和手术治疗. 而要准确、恰当、及时的治疗需要对其机制更为了解, 腺泡细胞死亡方式是AP的研究的一个重点, 主要包括凋亡、坏死、程序性凋亡、自噬和焦亡等, 部分研究证明腺泡细胞死亡方式影响AP病情转归, 凋亡能减轻炎症反应, 而坏死加重炎症反应. 而本文主要是从miRNA方面研究其对AP凋亡的影响及其可能的作用机制. 从一个更小的分子层面进行研究以期为以后的临床治疗提供理论基础和依据.

由于对文化建设的重要性认识不到位和资金投入不足等原因，在经济社会发展过程中文化建设往往都具有滞后性，而且主要是从场馆设施、机构设置、队伍建设、演艺院线、活动组织、文化下乡等方面针对问题和不足而进行的“补课”，表现出哪有问题就抓哪里、哪里有不足就补哪里。随着党对文化建设的不断重视，特别是在党的十八大召开之后为贯彻落实党的十八大精神，广州的文化建设又迈出了新的步伐，开始进入由“文化补课”转向“文化驱动”的发展提升期。

图6 敲减miR-7和抑制Sp3表达对雨蛙素处理AR42J细胞凋亡的影响.

实验动机

本研究的主题是miRNA-7对AP增殖凋亡的影响, 拟解决的关键问题是了解miRNA-7是如何影响AP细胞的增殖和凋亡, 以及其和特异性蛋白3(specific protein 3, Sp3)之间的关系及他们对AP的影响, 拓展AP的发生发展机制, 为以后临床上的诊断治疗等提供新思路和依据.

实验目标

研究的主要目标即miRNA-7, Sp3, AP之间的联系, 研究得到miRNA-7和Sp3均在AP中异常表达, 敲减miRNA-7和过表达Sp3均可抑制雨蛙素处理AR42J细胞凋亡, 且miR-7靶向负调控Sp3. 可以从调控AP凋亡的途径来调控其进展, 为其治疗提供新思路.

实验方法

本研究首先是用雨蛙素处理大鼠胰腺腺泡来构建AP的模型, 通过ELISA法检测淀粉酶(amylase, AMY)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)的水平变化检验模型构建成功.转染miRNA-7和Sp3的过表达和抑制表达载体质粒, 通过流式细胞术检测细胞凋亡, Western blot检测Sp3蛋白表达, qRT-PCR检测miRNA-7和Sp3 mRNA表达水平, 荧光素酶报告基因检测实验检测miR-7与Sp3之间的靶向关系.

实验结果

本实验的结果是在雨蛙素构建的A P模型细胞中,miR-7的表达水平显著升高; Sp3的表达水平显著降低(P＜0.01). 敲减miR-7、过表达Sp3腺泡细胞凋亡率降低.miR-7靶向负调控Sp3; 抑制Sp3表达逆转了敲减miR-7对雨蛙素处理AR42J细胞的凋亡抑制作用. 达到了本实验的目的, 对该领域AP的发病进展机制又多了一份理论依据. 以后可以进一步从临床方面进行应用.

实验结论

miR-7靶向负调控Sp3; 敲减miR-7、过表达Sp3抑制腺泡细胞凋亡. 可以通过调控miR-7影响AP的进展. 从miRNA角度去研究其对AP的影响拓宽了研究的范围,可更深层次多角度的去了解AP.

展望前景

本研究仅是在实验的小鼠上进行研究, 有一定的局限性, 仅限于理论层面, 对于到人的影响还有一定的距离.本研究未来研究的方向是进一步深入的研究调控miR-7和Sp3对治疗AP小鼠的影响及其可能会产生的现象等.最佳方法是寻找更接近于真实AP的小鼠或者与人AP更为相似的受体.