碳源和微生物协同负载体系建构的研究

张燕妮，祝余辉，杨 柳，任迎港，张媛媛，伊佳伟，夏远乾，方晓军，孙 燕

（杭州师范大学钱江学院，浙江 杭州 310036）

0 前言

微生物固定化技术研究进展。微生物固定化技术是生物工程领域的一项新兴技术，是用化学的或者物理的手段和方法将游离细胞或酶定位在某一特定空间范围内，以提高其浓度，使其保持较高的生物活性并反复利用的方法[1]。已报道的菌剂包埋载体材料包括天然材料棉纤维[2]、改性的竹炭材料、复合聚氨酯泡沫、经处理的聚乙烯醇材料[3]。2015年，王青松等采用多种载体材料:海藻酸钠、聚乙烯醇、硅藻土、竹炭粉等混合制得一种性能良好的净水菌胶囊[4]。

国内外关于碳源缓释技术在污水处理中的研究。我国河道污染水体碳氮比（C/N）水平普遍较低[5]，在较多数情况下，需要投加外来碳源提高污染水体的脱氮效率。通常水体生物脱氮常用的碳源补充形式以甲醇[6]、乙醇[7]、乙酸[8]、葡萄糖、蔗糖等为主。其中甲醇、乙醇和乙酸等液态且具有一定毒性或易燃的碳源在运输及使用上存在一定风险[9]；投加方式多采用直投，使用中容易产生分布不均、局部过量等问题，从而导致污水处理效果不理想或造成二次污染。近年来，学者们开始研究和寻找一些新型的固态缓释碳源。

本研究将系统开展固体碳源醋酸钠负载及缓释技术研究，并结合高效降解污染物的菌剂（市售芽孢杆菌）固定化技术，构建微生物固定化/碳源缓释协同作用的新型污染河道生物强化处理技术。

1 实验部分

1.1 实验药品和仪器

乙基纤维素（CE），国药集团化学试剂有限公司；醋酸钠，国药集团化学试剂有限公司；十二烷基硫酸钠，上海强顺化学试剂有限公司；丙酮，衢州巨化试剂有限公司；竹炭，浙江常青化学试剂有限公司。

台式离心机，美国贝克曼库尔特有限公司；差示扫描量热仪（DSC），美国TA仪器有限公司；傅里叶红外光谱仪，浙江精科计量仪器有限公司；紫外分光光度计，上海精密仪器有限公司。

1.2 实验步骤

1.2.1 微球粒子的制备

（1）取适量的乙基纤维素溶于丙酮溶液中，并随后加入醋酸钠粉末，在30℃水浴中，在250 r/min 磁力搅拌 20 min，搅拌后，配制成 1．5～4．5 mg/mL的醋酸钠溶液。

（2）在第一步的基础上，往溶液中加入0．5%的十二烷基硫酸钠100 mL，并保持30℃的水浴环境，继续搅拌直到溶液冷却到室温。

（3）将已经冷却好的溶液进行过滤处理，得到微囊并用水洗涤后在室温下干燥得到微球型聚合物。

（4）取不同重量的乙基纤维素和丙酮溶液按照预定的比例配比，在一定条件下磁力搅拌待混合均匀后，将含有0．5%的SDS溶液慢慢地滴入到混合的溶液中去，并控制滴加的速度保持稳定且中速，加入完成后继续磁力搅拌一直到溶液冷却至室温为止，记录实验比例，将冷却后的溶液进行过滤，得到微球粒子并在室温下干燥。

（5）将乙基纤维素配成一定浓度，按照50 g/100 mL的比例加入竹炭粉，按照5 g/100 mL的比例加入菌粉，混合均匀后加工成型，并在35℃下烘干过夜。

1．2．2 微球粒子中醋酸钠包封率的测定

包封率的计算公式为:

包封率（%）=X包/X总×100%

X包—经过滤处理后上清液中醋酸钠的量

X总—加入的样品量

记Lp(0,T;Hk(Ω))={u(x,t)|u(·)∈Hk(Ω),a.e t∈[0,T]}，其范数定义为

1．2．3 醋酸钠的释放率测定

准确称取一定量的微球粒子放入蒸馏水中制成水溶液，然后设置不同的时间间隔，用滴定法分别测出其中的醋酸钠的含量，以此来计算出试样的释放率。

释放率的计算公式为:

释放率 （%）=Y放/Y总*100%

Y放—微球粒子水溶液中醋酸钠的量

Y总—加入的品量

1．2．4 平板法测菌落分析

（1）称量出5 g的用研钵研磨，放入装有100 mL稀释液的无菌均质杯中，机械摇匀，再用无菌吸管再一次进行稀释操作得到试样。

（2）用细菌管吸取适量的试样放入9 cm培养皿中并加入平板计数琼脂充分混合，在30℃下培养。

（3）培养12 h后，用肉眼观察菌落数并记录实验结果。

2 结果与讨论

2.1 碳源/微生物缓释材料的外观

由图1可知:A为制备过滤干燥处理后的微球粒子呈白色细粉末状。B为将A的微球加入适量的有机物经过一定的温度处理后可以得到光滑的粒状的结构。C为竹炭和纤维素在加入菌粉的微球在一定条件的处理下可制成空隙较大、空隙分布较均匀的2×5 cm大小的椭球体。

图1 碳源/微生物缓释材料的外观（A为醋酸钠纤维素微球，B为有机高分子包裹的负载醋酸钠的乙基纤维素微球，C为加入菌粉和醋酸钠的竹碳和醋酸纤维素复合材料微球图）Fig．1 Appearance of carbon source/microorganism sustained-release material（A is sodium acetate cellulose microsphere，B is organic polymer-coated ethyl cellulose microsphere loaded with sodium acetate，Cis bamboo carbon powder and cellulose acetate composite microsphere added with bacterial powder and sodium acetate）

2.2 负载微球粒子的包埋率分析

由表1可知，随着乙基纤维素和醋酸钠的质量比增加的时候，包封率是增加的，在两者质量比为1∶1的时候，包埋率达到最高，为24.16%。

表1 负载微球粒子的包埋率表Tab.1 The embedding rate table for loaded microsphere particlesacetate

2.3 醋酸钠的释放率分析

图2 负载醋酸钠微球的释放率随时间的变化曲线图Fig.2 The curve of the release rate of sodium acetate loaded microspheres over time

图2 所示是表1中包封率最大的微球在不同的时间间隔下所测的醋酸钠释放曲线。通过比较可以看出累积释放率持续增加，呈匀速释放状态，并且到释放1天后，累积释放率只有12%，达到了较好的缓释效果。

2.4 竹炭微球的菌落分析

图3所示是负载醋酸钠和菌粉的复合微球的细菌培养照片。其中，图3-A是起始的培养基照片，图3-B是培养12 h后的培养基照片。图3-B说明经过一定时间的培养后出现了明显的菌落，这说明包埋进去的细菌能够依然存活着并且正常繁殖了，说明包埋成功了。

图3 菌落培养实验图Fig.3 The experimental diagram of colony culture

2.5 差示扫描量热分析（DSC）

图4差示扫描量热图（A:碳源负载乙基纤维素；B:乙基纤维素）Fig.4 The differential scanning calorimetry（A:carbon source loaded ethyl cellulose； B:ethyl cellulose）

图4 是乙基纤维素（B）和负载醋酸钠的乙基纤维素（A）的示差扫描量热分析图。其中纯的乙基纤维素在175℃左右有一个较明显的台阶，是乙基纤维素的玻璃化转变温度。而包埋醋酸钠后的乙基纤维素在此温度区间没有出现玻璃化转变台阶，说明醋酸钠与乙基纤维素之间发生了物理的或化学的相互作用。纯的乙基纤维素在225℃左右有一个小的吸热峰，说明是乙基的脱出；而包埋醋酸钠的乙基纤维素吸热峰值温度却向高温方向移动了，大概在260℃左右出现一个小的吸热峰，这同样说明醋酸钠与乙基纤维素之间的相互作用，导致乙基的脱除温度变高。

2.6 红外光谱分析（FTIR）

图5 红外光谱图A：乙基纤维素 B：碳源负载乙基纤维素Fig.5 The infrared spectrum.A：ethyl celluloseB：carbon source loaded ethyl cellulose

图5 所示是乙基纤维素和负载醋酸钠的乙基纤维素的红外光谱图。由图4-A所示在1100 cm-1处有仲醇的羟基伸缩振动峰；而包埋醋酸钠后此处的峰值明显变弱（如图4-B），说明醋酸钠与乙基纤维素的羟基发生了化学作用。

3 结论

本项目成功地制备了碳源/微生物协同负载的缓释体系，研究证明，碳源显示较好的缓释性能；对用竹炭纤维素和菌粉制得的微球的平板菌落检测，说明微生物成功地被包埋进去并且保持了较良好的繁殖能力。