铁皮石斛对免疫力低下小鼠巨噬细胞吞噬作用的谱效关系▲

谢唐贵 陈敬民 李燕婧 蓝保强 蒋珍藕

(1 广西中医药研究院药理所，南宁市 530022，电子邮箱：505076561@qq.com；2 广西中药质量标准研究重点实验室，南宁市 530022；广西中医药研究院3 制剂中心，4 中药所，南宁市 530022)

铁皮石斛为兰科植物铁皮石斛干燥茎，具有益胃生津、滋阴清热的功效，可治疗阴虚火旺、胃阴不足、口干烦渴、热病津伤、骨蒸劳热、目暗不明等症[1]。研究显示，铁皮石斛有祛疲劳、提高免疫力、保肝、降血糖和促进消化等作用[2]，但目前尚无相关药理作用与其化学成分之间的关联性研究报道。近年来提出的“谱-效”分析研究[3]，是指应用指纹图谱和统计学方法分析中药的化学成分与其药效的关系，是阐明中药药效物质基础的重要手段之一。免疫调节是铁皮石斛发挥滋阴功效的药理作用之一。本文以免疫低下小鼠巨噬细胞的吞噬能力作为药效考察指标，以指纹图谱表达铁皮石斛物质组分，采用偏最小二乘回归法(partial least squares regression,PLSR)分析两者间的关联性，探讨铁皮石斛中具有增强免疫功能的物质，为铁皮石斛的开发与应用提供参考依据。

1 材料与试剂

1.1 主要仪器 LC-20AT型高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)仪以及Shim-pack VP-ODS色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)均购于岛津公司， 1510型酶标仪购于Thermo Fisher公司。

1.2 药材 铁皮石斛的产地分别为广西凌云县、广西容县、广西桂林市、云南文山，均经本院中药所鉴定为铁皮石斛的干燥茎。

1.3 主要试剂 环磷酰胺(山西普德药业股份有限公司，批号：04150102)，碳酸钠(广东光华科技股份有限公司，批号：20150415)，甲醇(色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司，批号：150515)，乙腈(色谱纯，德国默克公司，批号：JA034130)。

1.4 实验动物 6周龄昆明种小鼠100只，由广西医科大学实验动物中心提供(许可证号：SCXK桂2014-0002)，体质量18～22 g，雌雄各半，饲养于无特定病原体级实验室。

2 方法与结果

2.1 铁皮石斛水提取物及醇提取物的制备 将铁皮石斛粉碎为24目颗粒，加水(或乙醇)浸泡1 h，煎煮(或回流加热)提取，1 h/次，共3次，合并提取液，过滤、浓缩、干燥成粉末，即得水(或醇)提取物。

2.2 供试品溶液的配制 精密称取铁皮石斛水(或醇)提取物适量，加50%甲醇(或100%甲醇)25 mL，称定重量，回流加热(或超声处理，处理参数240 W、40 kHz、40℃)30 min，冷却，用50%甲醇(或100%甲醇)补足重量，摇匀，4 000 r/min离心10 min，取上清液滤过，滤液即为供试品溶液。

2.3 药效实验样品配制 称取水(或醇)提取物，蒸馏水溶解，配制成所需浓度。

2.4 指纹图谱的建立

2.4.1 色谱条件：色谱柱均为Shim-pack VP-ODS柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。(1)水提取物：流动相为甲醇(A)-水(B)。梯度洗脱：0～10 min,5%～12% A；10～30 min,12%～23% A；30～50 min,23%～5% A。体积流量为1.0 mL/min，进样量为10 μL；检测波长为254 nm，柱温为25℃。(2)醇提取物：流动相为乙腈(A)-水(B)。梯度洗脱：0～10 min,8%～15% A；10～38 min,15%～28% A；38～50 min,28%～20% A；50～65 min,20%～8% A。体积流量为1.0 mL/min，进样量为10 μL；检测波长为310 nm，柱温为30℃。

2.4.2 方法学考察：依据《中华人民共和国药典(2015年版四部)》[4]规定的精密度、稳定性、重复性考察实验方法学，指纹图谱相似度的相对标准偏差均小于2.2%，符合药物分析要求。

2.4.3 HPLC指纹图谱：按上述的色谱条件开展实验，记录50～65 min HPLC图；应用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012.130723版本)软件(时间窗为0.4，生成的色谱方法为平均值)，多点校正色谱峰后进行匹配，形成各供试品的HPLC指纹图谱。对各供试品各色谱峰的响应值进行综合，将具有3个以上的共有峰或2个响应值较大的共有峰作为特征色谱峰；并将各供试品进样量换算成mg生药量，校正各特征色谱峰的峰面积，无色谱峰的对应峰面积为0，共提取出30个特征色谱峰，见表1。

表1 各样本色谱峰对应的校正峰相对面积

2.5 铁皮石斛对免疫低下小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响 将100只小鼠按随机区组法分为正常组、模型组及8个样品组，每组10只，按照文献[5]的方法进行实验。各样品组按1.633 g生药/kg对小鼠进行灌胃给药，正常组、模型组小鼠分别给予蒸馏水0.2 mL/10 g灌胃，1次/d，共10 d。除正常组外，其余各组小鼠分别于第3、7 d腹腔注射50 mg/kg环磷酰胺。末次给药后1.5 h，各小鼠尾静脉注射20%印度墨汁(生理盐水稀释)0.1 mL/10 g，注射后1 min(t1)及7 min(t2)，分别眼眶取血20 μL，溶于2 mL 0.1%碳酸钠溶液中，摇匀，酶标仪测定各血样680 nm处的吸光度A值，计算廓清指数，廓清指数=(lgA1-lgA2)/(t2-t1)，其中A1、A2分别为对应时间血样的680 nm处的吸光度A值。结果显示，模型组的廓清指数低于正常组(P<0.05)；与模型组比较，各水提取物样品组小鼠的廓清指数升高(均P<0.05)，但各醇提取物样品组小鼠的炭末廓清指数与模型组比较，差异无统计学意义(均P>0.05)，见表2。

表2 8组小鼠廓清指数比较(n=10，x±s)

注：与正常组比较，△P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。

2.6 谱效分析 按照文献[6]方法开展炭末廊清指数与色谱峰间的谱效分析。廓清指数按(各提取物组-模型组)/(正常对照组-模型组)×100%进行预处理。以预处理后的廓清指数作为因变量Y，各供试品特征峰的峰面积作为自变量X，采用SIMCA-P 13.0软件的PLSR进行谱效分析。经软件PLSR拟合，该模型标准化数据回归方程为Y=(-3.78X1+4.21X2-2.61X3+5.91X4-4.74X5+5.91X6-9.82X7+5.61X8-3.80X9+6X10+1.73X11-1.62X12+6.12X13+5.62X14+5.21X15+3.85X16+5.75X17+5.49X18+4.4X19-3.2X20+6.72X21-3.48X22+5.45X23+1.17X24-0.73X25-2.44X26+4.84X27+4.21X28+0.4X29-3.53X30)×0.01 ，经交叉验证方差分析,该谱效关系PLSR分析模型有统计学意义(P<0.05)，见表3；X相对于Y有统计学意义(P<0.05)的回归系数有21个色谱峰，见图1。其中可增强巨噬细胞吞噬功能的色谱峰为第4、6、8、10、11、14、15、17、18、21、23、27号，共12个。色谱峰UV标准化峰面积相对于廓清指数的相关系数见表4。

表3 色谱峰与廓清指数PLSR模型的相关系数

图1 单位方差标准化色谱峰面积对廓清指数提高率的回归系数及其95% CI

表4 色谱峰UV标准化峰面积相对于廓清指数的相关系数

3 讨 论

中药的药效是多种化学成分共同作用的结果，某些化学成分与其药效间存在着必然且紧密的联系。PLSR是一种有广泛适用性的多元统计方法，综合了典型相关分析、主成分分析及多元线性回归分析等多种统计分析的功能，可统计分析出因变量与自变量间的相关性、贡献度，从而揭示中药化学成分对药效指标的综合作用，近年来常被应用于中药谱效关系研究。本研究采用PLSR分析铁皮石斛的提取物与免疫低下小鼠单核巨噬细胞吞噬功能间的谱效关系，模型回归系数的绝对值反映了色谱峰所代表物质对廓清指数影响的贡献强弱。该模型提取的两个主成分对自变量X解释能力(R2X)达到72.8%，对因变量Y的解释能力(R2Y)和预测能力(Q2)分别达到99.3%和96.8%，表明PLSR模型有良好的解释和预测作用。

廓清指数PLSR模型的正数回归系数中具有统计学意义的有12个色谱峰，其中10个来源于水提取物，X13和X21色谱峰同时来源于水提物、醇提物，但水提物的色谱峰面积分别为醇提取物的15.79、9.10倍，由此可推断，可增强机体单核巨噬细胞吞噬功能的铁皮石斛化学成分主要存在于水提取物中，其色谱峰分别为X4、X6、X8、X10、X13、X14、X15、X17、X18、X21、X23、X27。经SPSS 23.0分析，X4、X8、X13等3个色谱峰UV标准化峰面积相对于Y的相关系数分别为0.953、0.919、0.931，具有极强相关性；X10、X14、X15、X18、X21、X23等6个色谱峰UV标准化峰面积相对于Y的相关系数分别为0.848、0.873、0.823、0.875、0.888、0.898，具有强相关性；其余3个色谱峰UV标准化峰面积相对于Y的偏相关系数在0.7～0.8之间，具有较强相关性。

模型拟合方程的负数回归系数中具有统计学意义的有9个色谱峰，均来源于醇提取物，由此推断，抑制机体单核巨噬细胞吞噬功能的铁皮石斛化学成分主要存在于醇提取物中，其色谱峰分别为X1、X3、X5、X7、X9、X20、X22、X26、X30。因铁皮石斛化学成分类别众多、成分结构复杂，这些色谱峰，尤其是可增强机体单核巨噬细胞吞噬功能的色谱峰，所对应的具体化学成分有待进一步研究确定。