N,N′-二环己基-N-亚麻酸酰脲的体外抗肿瘤活性▲

翚明莉 莫斯锐 欧冰凝 秦 箐

(1 广西医科大学药学院天然药物化学教研室，南宁市 530021，电子邮箱：540993602@qq.com；2 右江民族医学院药学院药剂学教研室，3 广西高校右江流域特色民族药研究重点实验室，百色市 533000)

我国癌症的发病率和死亡率呈上升趋势，其死亡率仅次于心血管疾病[1]。目前，治疗癌症的方法主要有传统手术、化疗和放疗，但这些方法的副作用较大，因此中药提取物及其抗癌中药配伍成为抗癌研究的热点[2]。板蓝根性寒味苦，具有清热解毒、凉血利咽的功效。本课题组前期从板蓝根中分离提取出一组高级不饱和脂肪酸，又称板蓝根组酸，发现其具有一定的免疫调节作用和抗肿瘤活性[3]；再以板蓝根组酸为先导化合物进行构效关系研究，发现该化合物结构中的羧基既是抗肿瘤活性基团，也是溶血基团[4]。因此，我们进一步对羧基进行结构修饰并进行抗肿瘤活性研究，发现N,N′-二(2-氯乙基)-芥酸酰胺(即化合物J)具有良好的抗肿瘤活性和逆转多药耐药的作用[5-6]，而N,N′-二环己基-N-山嵛酸酰脲(即化合物K)具有明显的免疫调节作用[7]，但两者水溶性较差，在水溶液中易析出，不利于体外实验的量效评价，因此进一步对碳链进行修饰，获得到具有良好抗肿瘤活性的化合物N,N′-二环己基-N-亚麻酸酰脲(即化合物MSR405)[8]。本研究从细胞水平探讨化合物MSR405的抗肿瘤活性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试剂：RPMI 1640培养基(批号：8117256)、杜氏改良伊格尔培养基(批号：8116486)均购自美国Gibco公司，胎牛血清(批号：18050302)购自杭州四季青生物工程材料有限公司，1×磷酸缓冲盐溶液(phosphate-buffered saline,PBS；批号：20180627)、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(批号：20180815)、青霉素/链霉素混合液(批号：20180306)、吖啶橙-溴乙锭双染试剂盒(批号：CA1140)均购自北京索莱宝科技有限公司，四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT；批号：1123A053)购自美国Sigma公司，膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-fluorescein isothiocyanate，Annexin V-FITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)细胞凋亡检测试剂盒(批号：1957502)购自Thermo Fisher Scientific公司。化合物由本课题组合成纯化而来，合成方法参照文献[8]。

1.1.2 仪器：水浴锅(型号：WB-2000)购自郑州长城科工贸有限公司，小型高速离心机(型号：Micro17R)购自Thermo Fisher Scientific公司，连续光谱扫描仪(型号：SpectraMAX Plus384)购自香港分子仪器公司，二氧化碳恒温培养箱(型号：Scientific 3111)购自德国Thermo Forma公司，倒置显微镜(型号：CKX-41)购自日本Olympus公司、十万分之一电子天平(型号：XS205DU)购自梅特勒-托利多国际贸易有限公司，流式细胞仪(型号：FACS Cliblur)购自美国BD公司。

1.1.3 细胞株：肝癌细胞株Bel-7402购自上海美轩生物科技有限公司，肝癌细胞株Hep-G2、肝癌细胞株SMMC-7721、卵巢癌细胞株SKOV3均由广西医科大学药理生理学实验室传代。

1.2 实验方法

1.2.1 MSR405体外抗肿瘤活性筛选：用含0.25%乙二胺四乙酸的胰蛋白酶消化处于对数生长期且生长状态良好的肝癌细胞株Bel-7402、Hep-G2、SMMC-7721和卵巢癌细胞株SKOV3，室温下8 000 r/min离心5 min后重悬调整细胞浓度为1×105个/mL，以每孔100 μL接种细胞于96孔板中，PBS封边，于37℃、5% CO2的恒温培养箱中培养24 h，待细胞贴壁后，分为阴性对照组(不加药组)、空白调零组(无细胞无药组)、MSR405药物组(药物浓度分别为500 μg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL、62.5 μg/mL、31.25 μg/mL)，每组设4个复孔。给药24 h后弃去培养基，每孔避光加入20 μL浓度为5 mg/mL的MTT溶液，在恒温培养箱中避光继续孵育4 h后弃掉MTT，每孔加入150 μL二甲基亚砜，于摇床上摇匀，放置在酶标仪上，于波长490 nm处测定A值，重复实验3次，取平均值计算抑制率。抑制率=[(阴性对照组A值-空白凋零组A值)-(MSR405药物组A值-空白凋零组A值)]/(阴性对照组A值-空白凋零组A值)×100%。

1.2.2 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况：用含0.25%乙二胺四乙酸的胰蛋白酶消化对数生长期细胞Bel-7402、SMMC-7721，调整细胞浓度为5×106个/mL，以1 mL/孔接种于6孔板中，待细胞贴壁后，分别给予药物浓度为60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL、120 μg/mL的MSR405，24 h后收集所有细胞，以不给药的细胞作为阴性对照，严格按照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，采用BD流式细胞仪检测细胞在早期和晚期凋亡中的分布。

1.2.3 观察细胞形态变化：用含0.25%乙二胺四乙酸的胰蛋白酶消化处于对数生长期的肝癌细胞Bel-7402、SMMC-7721，室温下8 000 r/min离心5 min重悬后调整细胞浓度为5×106个/mL，以1 mL/孔接种于6孔板中，待细胞贴壁后，分别给予药物浓度分别为60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL、120 μg/mL的MSR405，给药24 h后用1×PBS洗去漂浮的死细胞，然后每孔加1 mL PBS、10 μL吖啶橙染料和10 μL溴乙锭染料，室温放置2～5 min后于荧光显微镜下观察细胞形态。在荧光显微镜下可观察到4种细胞形态，其中核染色质呈绿色且细胞结构正常为活细胞，核染色质呈绿色且细胞结构固缩为早期凋亡细胞，核染色质呈橘红色且细胞结构固缩为晚期凋亡细胞，核染色质呈橘红色且细胞结构正常为非凋亡的死亡细胞。

1.3 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行数据分析。计量资料均以(x±s)表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同浓度MSR405对不同癌细胞增殖的抑制作用 阴性对照组对不同癌细胞增殖的抑制作用均为0，不同浓度MSR405作用下，Bel-7402、SMMC-7721、Hep-G2肝癌细胞株和SKOV3卵巢癌细胞株的增殖均受不同程度地抑制，见表1。

表1 不同浓度MSR405干预下不同癌细胞的增殖抑制率(x±s，%)

2.2 不同浓度MSR405对肝癌细胞凋亡率的影响 与阴性对照组比较，经各浓度MSR405处理后肝癌细胞Bel-7402、SMMC-7721的凋亡率均升高(均P<0.05)。MSR405浓度为80～120 μg/mL时，两种肝癌细胞的凋亡率随着MSR405浓度增大而升高(均P<0.05)。见表2及图1～图2。

表2 不同浓度MSR405干预下肝癌细胞Bel-7402和SMMC-7721的凋亡率(x±s，%)

注：与阴性对照组比较，*P<0.05；与60 μg/mL比较，&P<0.05；与80 μg/mL比较，#P<0.05；与100 μg/mL比较，@P<0.05。

图1 不同浓度MSR405对Bel-7402细胞凋亡的影响

图2 不同浓度MSR405对SMMC-7721细胞凋亡的影响

2.3 不同浓度MSR405对细胞SMMC-7721细胞形态的影响 阴性对照组以正常细胞为主，细胞呈绿色且结构完整；各药物组的细胞结构呈圆柱状或固缩状、团块状，随着化合物MSR405浓度的增加，细胞凋亡数量增加。见图3～4。

图3 不同浓度MSR405对细胞Bel-7402细胞形态的影响(吖啶橙-溴乙锭染色，×200)

图4 不同浓度MSR405对细胞SMMC-7721细胞形态的影响(吖啶橙-溴乙锭染色，×200)

3 讨 论

饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸在抗肿瘤中的应用，已成为人们关注的重点，尤其是多不饱和脂肪酸[9-13]。多不饱和脂肪酸是具有18～22个碳原子的碳链，且含有两个或两个以上双键的直链脂肪酸，分为ω-6和ω-3不饱和脂肪酸两种类型，目前ω-3不饱和脂肪酸中的二十二碳碳烯酸和二十碳五烯酸是人体最重要的不饱和脂肪酸。本研究中的化合物亚麻酸属ω-3系列，是人体的必需脂肪酸。亚麻酸不仅具有抗肿瘤活性，还具有抗炎[14]以及辅助治疗阿尔茨海默病[15]的作用，是近年来的研究热点之一。

本课题组一直关注经结构修饰后可使高级不饱和脂肪酸达到高效低毒目标的板蓝根组酸，最具典型的化合物是化合物K和化合物J。本课题组的前期体外实验提示，化合物J在浓度低于100 μg/mL时，对人脐静脉血管内皮细胞无抑制作用，具有一定的安全性，该化合物对癌细胞的抑制效果不明显，但在体内实验中其具有明显的抗肿瘤作用[16]。同时，体外实验结果显示，化合物J具有逆转多药耐药的作用，其逆转机制可能与化合物J通过下调谷胱甘肽转移酶-π表达，使肿瘤细胞对化疗药物的敏感性增强有关；在体外实验中，化合物K浓度高于400 μg/mL时才具有抑制癌细胞增殖的作用，但在免疫调节方面，其可抑制脾细胞的增殖，与免疫抑制剂合用时可延长小鼠的生存时间，明显降低CD4+/CD8+T细胞比例[17]。化合物MSR405是以板蓝根组酸为先导化合物合成的，在体外抗肿瘤实验中，其对癌细胞的抑制作用较化合物J和化合物K更明显[8]。本研究结果显示，不同浓度MSR405对Bel-7402、SMMC-7721、Hep-G2肝癌细胞株和SKOV3卵巢癌细胞株增殖均有不同程度的抑制作用。与阴性对照组比较，经各浓度MSR405处理后肝癌细胞Bel-7402、SMMC-7721的凋亡率均升高(均P<0.05)，且当浓度≥80 μg/mL时，Bel-7402和SMMC-7721细胞的凋亡率随着MSR405浓度增大而升高；经不同浓度MSR405处理后，细胞结构呈圆柱状或固缩状、团块状。这提示在一定浓度范围内，MSR405对肝癌细胞Bel-7402、SMMC-7721的促凋亡作用呈剂量依赖性，这为板蓝根组酸衍生物的抗肿瘤活性(如肿瘤多药耐药逆转等)及免疫调节研究奠定理论基础，但其抗肿瘤机制有待进一步研究。

综上所述，MSR405对Bel-7402、SMMC-7721、Hep-G2和SKOV3细胞株的增殖均有不同程度的抑制作用，在一定浓度范围内其对肝癌细胞Bel-7402、SMMC-7721的促凋亡作用呈剂量依赖性。