荔枝核提取液预处理对小鼠急性酒精性肝损伤的缓解作用▲

黄景珠 莫 庸 黄继杰 黎 璇 何幸娟 李晓潇 方晓燕 黄丽娟

(右江民族医学院1 临床医学院，2 形态学实验教学中心，3 生理学教研室， 广西百色市 533000，电子邮箱：2271636381@qq.com)

酒精性肝病通常发生于过度饮酒者，或短时间内大量饮酒者[1]。氧化应激在酒精性肝损伤的发生中起着重要的作用[2-4]。 荔枝核为荔枝干燥的成熟种子,主产于我国广东、广西、福建、四川和台湾等地区,是我国历版药典收载的中药，其味甘、涩，归肝、肾经，包含氨基酸、脂肪酸、甾醇、皂苷、黄酮等多种化合物[5-6]。有研究表明，荔枝核具有抗氧化，清除自由基，降低HBsAg、HBeAg和HBV-DNA等生物活性，并具有降血糖、调血脂、抗肝损伤和肝纤维化等药理作用[6-8]。本研究通过探讨荔枝核提取液预处理对小鼠急性酒精性肝损伤的缓解作用，为研究荔枝核的护肝作用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无特定病原体级昆明种小鼠50只，3周龄，雌雄性别不限，体重(23±2)g，由右江民族医学院实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK桂2017-0003。常规颗粒饲料喂养，自由饮食，饲养环境温度26℃～27℃,湿度40%～60%。

1.2 主要试剂及仪器 荔枝核购自广西贵港市绿之源种养发展有限公司(批号：150604)；牛栏山二锅头56°白酒(北京顺鑫农业股份有限公司，批号：161027)；联苯双酯滴丸(北京协和药厂,批号:15100102)。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所(批号：20171227、20171227)。7600型全自动生化分析仪购自株式会社日立高新技术公司，722型可见分光光度计购自上海精科实业有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 荔枝核提取液的制备：荔枝核晒干后敲碎，取荔枝核颗粒500 g,加1 000 mL蒸馏水浸泡6 h后，再加入4 000 mL蒸馏水小火煮沸1 h，过滤；滤渣加入4 000 mL蒸馏水煎煮1 h，过滤后合并滤液；将所得滤液水浴浓缩，最终得浓缩滤液250 mL,浓缩滤液生药浓度为2 g/mL，分装于-20℃冰箱保存备用。

1.3.2 分组与造模：小鼠适应性饲养1周后,采用随机数字表法将小鼠分成正常对照组、模型组、阳性对照组(联苯双酯组，0.2 g/kg)、荔枝核低剂量组(20 g/kg荔枝核提取液)、荔枝核高剂量组(40 g/kg荔枝核提取液)，每组10只。正常对照组和模型组按0.2 mL/10 g生理盐水灌胃，其余组给予相应剂量药物灌胃，1次/d，连续20 d。末次给药2 h后，除正常对照组给予生理盐水灌胃外，其余各组均用56°白酒按15 mL/kg灌胃1次，建立急性酒精性肝损伤模型。造模后禁食12 h。

1.3.3 标本收集：禁食12 h后，摘除眼球收集血液标本0.6～0.8 mL，以2 500 r/min离心10 min后，取上层血清进行检测。

1.3.4 检测方法：(1)采用全自动生化分析仪检测血清AST、ALT水平。(2)取肝左叶0.5 g，加入4.5 mL的0.9%生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆，制成10%的匀浆液，以2 500 r/min离心10 min后，取上清液。按试剂盒说明书操作，用可见分光光度计测定血清和肝组织SOD(羟胺法，波长550 nm)及丙二醛(硫代巴比妥酸法，波长532 nm)的吸光度值。根据试剂盒说明书提供的公式计算血清和肝组织各项指标的含量或活性。(3)另取肝组织，甲醛固定、常规石蜡包埋，经苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色后，光镜下观察各组肝组织病理形态学改变。

1.4 统计学分析 采用SPSS 19.0软件统计分析。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 5组小鼠血清ALT和AST水平比较 与正常对照组比较，各组血清ALT和AST水平均增高(均P<0.05)；与模型组相比，各用药组血清ALT和AST水平均降低(均P<0.05)；与荔枝核低剂量组比较，荔枝核高剂量组和联苯双酯组血清ALT和AST水平均降低(均P<0.05)。见表1。

表1 5组小鼠血清ALT和AST水平比较(x±s，U/L)

注：与正常对照组相比，aP<0.01；与模型组相比，bP<0.01；与荔枝核低剂量组相比，cP<0.05。

2.2 5组小鼠血清SOD和丙二醛水平比较 与正常对照组比较，各组血清SOD水平均降低，模型组血清丙二醛水平升高(均P<0.05)。与模型组比较，荔枝核高剂量组血清SOD水平升高，荔枝核高剂量组和联苯双酯组血清丙二醛水平降低(均P<0.05)。与荔枝核低剂量组比较，荔枝核高剂量组血清SOD活性升高(P<0.05)。见表2。

2.3 5组小鼠肝组织SOD和丙二醛水平比较 与正常组比较，模型组肝组织SOD水平降低，模型组、荔枝核低剂量组、联苯双酯组肝组织丙二醛水平升高(均P<0.05)。与模型组比较，荔枝核高剂量组肝组织SOD水平升高，各用药组肝组织丙二醛水平下降(均P<0.05)。与荔枝核低剂量组比较，荔枝核高剂量组肝组织丙二醛水平下降(P<0.05)。见表3。

表2 5组小鼠血清SOD和丙二醛水平比较(x±s)

注：与正常对照组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05；与低剂量组相比，cP<0.05。

表3 5组小鼠肝组织SOD和丙二醛水平比较(x±s)

注:a与正常组相比，P<0.05；b与模型组相比，P<0.05；c与荔枝核低剂量组相比，P<0.05。

2.4 5组小鼠肝组织病理形态学变化 正常对照组小鼠肝组织结构正常，肝小叶内肝细胞无变性、坏死；肝窦无淤血、扩张。模型组小鼠肝小叶中央静脉淤血、扩张，肝细胞弥漫性水肿，胞浆疏松化，并出现气球样变，部分肝细胞溶解坏死，同时小叶周边部分肝细胞再生。与模型组相比，联苯双酯组和荔枝核低、高剂量组小鼠肝组织形态学变化有较大改善，小叶中央静脉淤血和扩张减轻，肝细胞水肿、溶解坏死亦减轻，以荔枝核高剂量组改善较为显著。见图1。

正常对照组 模型组 荔枝核低剂量组 荔枝核高剂量组 联苯双酯组

图1 5组小鼠肝组织病理形态学变化(HE染色，×100)

3 讨 论

ALT和AST是反映肝细胞坏死和炎症活动的指标[9]。肝细胞变性后细胞通透性升高，从细胞内逸出的酶主要是ALT；而当肝细胞严重病变坏死时，线粒体内的AST便释放出来[10]。本研究结果显示，模型组血清ALT、AST水平升高，且显微镜下可观察到小叶中央静脉淤血、扩张，弥漫性肝细胞水肿、胞浆疏松化及气球样变，部分肝细胞溶解坏死，说明成功建立小鼠急性酒精性肝损伤模型。与模型组相比，各用药组血清ALT和AST水平降低，且荔枝核高剂量组血清ALT和AST水平低于荔枝核低剂量组；同时，荔枝核低、高剂量组的肝组织病理变化均有较大改善，小叶中央静脉的淤血和扩张减轻，水肿、溶解坏死的肝细胞数量减少，细胞肿胀减轻，以荔枝核高剂量组改善较为显著。说明荔枝核提取液能预防酒精所致的急性肝损伤，且有一定的量效关系。荔枝核高剂量组的ALT和AST水平与联苯双酯组差异无统计学意义(P>0.05)，说明荔枝核高剂量组的护肝效应与联苯双酯组相当。

目前认为，急性酒精性肝损伤发生机制中的一个重要环节是酒精导致的氧化应激[11]。大量摄入乙醇后，内质网的微粒体乙醇氧化酶系统被诱导激活，促进乙醇氧化为乙醛，在此代谢途径中有大量活性氧生成；而氧化应激产物产生过多加快了肝细胞抗氧化物质的消耗，从而引起细胞膜脂质过氧化反应，导致肝细胞损伤[12]。SOD的主要功能是清除体内过多的氧化应激产物，其水平可反映清除自由基的速度，而丙二醛则反映了机体脂质过氧化物的代谢水平[13]。本研究结果显示，模型组小鼠血清和肝组织SOD水平低于正常对照组，而丙二醛高于正常对照组，说明酒精所致的急性肝损伤可引起机体产生大量自由基和脂质过氧化产物，导致机体抗氧化防御机制受损，从而引起肝细胞损伤。而经过荔枝核提取液干预的小鼠，其血清和肝组织SOD活性均不同程度升高，丙二醛水平均不同程度降低，其中荔枝核高剂量组肝组织及血清SOD、丙二醛与模型组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。原因可能是荔枝核提取液能减少脂质过氧化产物的产生，提高肝组织抗氧化酶的活性，提高机体清除氧自由基的能力，从而达到减轻急性酒精性肝损伤的作用。

综上所述，荔枝核提取液预处理对急性酒精性肝损伤小鼠具有一定肝脏保护作用，其机制可能与提高对自由基的防御能力和减轻氧化应激有关。