姜黄素逆转系统性红斑狼疮患者外泌体诱导的巨噬细胞吞噬功能受损

张淑娟 唐亚萍 梁景耀 刘玉梅

广州市皮肤病防治所皮肤科 510095

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种常见的累及多系统多器官的自身免疫性疾病[1]。早期研究认为，淋巴细胞异常是SLE发病的主要机制，近年固有免疫包括巨噬细胞的功能异常被逐渐重视[2]。SLE患者巨噬细胞清除凋亡细胞的能力下降，具有免疫原性的凋亡碎片大量累积，诱导淋巴细胞启动自身免疫反应[3]。Ren 等[4]发现，SLE 患者血清可诱导中性粒细胞凋亡，并下调正常巨噬细胞清除凋亡细胞的能力。Lee等[5]在后续研究中发现，SLE血清主要通过血液循环中外泌体起促炎症免疫反应的作用。姜黄素（curcumin）是从姜科、天南星科中的一些植物的根茎中提取的一种化学成分，为多酚类化合物，国内外研究表明其具有较强的抗肿瘤[6]及抗炎[7]作用。研究发现，姜黄素可通过上调巨噬细胞CD14表达，从而增强其吞噬功能[8]。本研究探讨姜黄素能否逆转SLE 患者外泌体诱导的巨噬细胞吞噬功能受损，为SLE的治疗提供新的线索。

对象与方法

一、研究对象

收集2016年2月至2017年11月广州市皮肤病防治所和中山大学孙逸仙纪念医院诊治的活动期SLE 患者18 例，年龄（28.4 ± 5.5）岁，病程中位数为23（P25，P75：3.75，35.0）个月，均为女性。诊断符合1997年美国风湿病协会（ACR）修订的SLE 分类标准，并排除其他自身免疫性疾病。SLE疾病活动度评分（SLEDAI）平均为11分，均≥5分。选取18例体检健康者作为健康对照。两组受试者年龄、性别差异无统计学意义。本研究经广州市皮肤病防治所医学伦理委员会审批通过（201501），所有患者均签署知情同意书。

二、主要试剂

人急性单核细胞白血病细胞株（THP-1，ATCC®TIB-202™）、RPMI 1640、胎牛血清（FBS）（美国Gibco 公司）、血清外泌体分离液（美国Life Technologies 公司）、佛波酯（PMA）（P8139，美国Sigma-Aldrich 公司）、兔抗人 CD14 单克隆抗体（ab183322，美国abcam 公司）、兔抗人β 微管蛋白（β-tubulin）多克隆抗体（#2146，美国CST 公司）、鼠抗人CD63单克隆抗体（NBP2-42225，美国Novus公司）、鼠抗人 CD81 单克隆抗体（ab79559，美国abcam 公司）、姜黄素（sc-200509，分子量368.38，美国 Santa Cruz 公 司 ）。 pHrodo ™ Red 指 示 剂（P35361，美国Life Technologies 公司）用于评估巨噬细胞吞噬功能。

三、方法

抽取受试者外周静脉血8 ml置于干燥管，静置30 min，1 500×g离心15 min分离血清，分装为600 μl一管，冻存于-80 ℃冰箱用于提取外泌体。

1.血清外泌体提取及鉴定：受试者血清外泌体提取及鉴定方法参考文献[9]。将18 例SLE 患者的外泌体（SLE-exo）每6例一组随机混合分为3组，18 例健康对照者外泌体（CON-exo）同样分为3 组。采用透射电镜观察提取的外泌体。CD63 与CD81为外泌体特异标记物，取25 μl外泌体采用Western印迹法检测CD63、CD81水平。

2.巨噬细胞的诱导、刺激及吞噬功能测定：使用含 10% FBS 的 RPMI 1640 培养基培养 THP-1 细胞，加入160 nmol/L PMA 刺激48 h 诱导为巨噬细胞。更换为含0.5%FBS 的RPMI 1640 培养基培养12 h，分为 4 组（SLE-exo 组、SLE-exo + 姜黄素组、CON-exo 组、CON-exo + 姜黄素组），分别以 SLE-exo 25 μl/ml、SLE-exo 25 μl/ml+ 姜黄素20 μmol/L、CON-exo25μl/ml、CON-exo25μl/ml+姜黄素20μmol/L刺激巨噬细胞24 h，检测刺激后巨噬细胞的吞噬功能。

巨噬细胞吞噬功能测定：pHrodo™Red 在中性环境不发荧光，被巨噬细胞吞噬后进入囊泡后pH下降，pHrodo™Red发出红色荧光。因此，本文使用pHrodo™Red阳性细胞比例反映具有吞噬功能的巨噬细胞比例；使用细胞平均红色荧光强度反映巨噬细胞的吞噬功能。巨噬细胞吞噬功能越强，pHrodo™Red 阳性细胞比例越高以及平均荧光强度越强。按照说明书，将pHrodo™Red 与巨噬细胞共孵育2 h，采用流式细胞仪测量荧光强度；采用免疫荧光染色检测pHrodo™Red 阳性细胞比例，pHrodo™Red阳性细胞比例=（红色荧光细胞数/DAPI 染色细胞数）×100%，每个样本随机取200 倍视野5 个并计算平均值。

3.刺激后巨噬细胞CD14水平：分为5组，CON-exo 组、SLE-exo 组、SLE-exo+ 姜黄素1 μmol/L 组、SLE-exo + 姜黄素 5 μmol/L 组、SLE-exo + 姜黄素20 μmol/L 组，刺激后的细胞使用蛋白提取裂解缓冲液（RIPA）+ 蛋白酶抑制剂（PMSF；1 mmol/L）提取蛋白，SDS-PAGE 电泳并转膜后，以GAPDH 为内参，检测CD14蛋白水平。

四、统计学方法

结 果

一、SLE患者血清外泌体及CD63、CD81的表达

分离纯化血清外泌体，电镜下见直径约100 nm茶托样囊泡结构，符合外泌体形态（图1）。Western印迹结果示，SLE组及健康对照组血清外泌体均表达 CD63 及 CD81，SLE 组 CD63 水平高于健康对照组（t=3.26，P=0.03），CD81 水平亦高于健康对照组（t=3.82，P=0.02）。见图2。

二、姜黄素对SLE患者外泌体刺激后巨噬细胞吞噬能力的影响

将pHrodo™Red 与巨噬细胞共孵育后，流式细胞仪检测 CON-exo 组、CON-exo + 姜黄素组、SLE-exo 组、SLE-exo + 姜黄素组相对荧光强度分别为101.3% ± 14.05% 、94.27% ± 14.13% 、41.02% ±9.54%、87.33% ± 15.01%，差异有统计学意义（F=10.81，P＜ 0.01），SLE-exo 组低于 CON-exo 组（t=5.26，P= 0.001）和SLE-exo + 姜黄素组（t= 3.97，P=0.004）（图3），CON-exo 组与CON-exo+ 姜黄素组差异无统计学意义（t=0.61，P=0.570）。

图1 分离纯化的血清外泌体在透视电镜下表现为直径约100 nm茶托样囊泡

图2 Western 印迹法检测系统性红斑狼疮（SLE）组与健康对照组血清外泌体CD63及CD81的水平 2A：Western印迹法检测外泌体中CD63、CD81 电泳图。18 例SLE 患者及18 例健康对照者的外泌体均每6例一组混合，各分为3组，1 ～3：分别为SLE 1 ～3组；4 ～ 6：分别为健康对照1 ～ 3 组；2B：外泌体CD63、CD81 表达水平。a：与健康对照组相比，P ＜0.05

免疫荧光染色检测CON-exo 组、CON-exo+姜黄素组、SLE-exo组、SLE-exo+姜黄素组pHrodo™Red阳性细胞比例分别为82.16% ± 5.20%、81.33% ±4.51%、54.20% ±9.31%、71.23% ±5.43%，4 组差异有统计学意义（F=12.42，P＜ 0.01），SLE-exo 组低于CON-exo 组（t=5.35，P=0.001）和SLE-exo+ 姜黄素组（t=3.26，P=0.011）。见图4。

三、姜黄素对SLE患者外泌体刺激后巨噬细胞CD14蛋白水平的影响

图3 健康对照组外泌体（Con-exo）、系统性红斑狼疮患者外泌体（SLE-exo）、Con-exo+姜黄素、SLE-exo+姜黄素刺激巨噬细胞后与pHrodo™Red染色剂共孵育，流式细胞仪检测荧光强度

图4 免疫荧光染色检测健康对照组外泌体（Con-exo）、系统性红斑狼疮患者（SLE-exo）外泌体、Con-exo+姜黄素、SLE-exo+姜黄素刺激巨噬细胞后pHrodo™Red阳性细胞比例 DAPI染细胞核，呈蓝色荧光，吞噬pHrodo™Red的巨噬细胞呈红色荧光

CON-exo 组、SLE-exo 组、SLE-exo + 姜黄素1 μmol/L 组、SLE-exo + 姜黄素 5 μmol/L 组、SLE-exo + 姜黄素20 μmol/L 组分别刺激巨噬细胞后，CD14 蛋白水平分别为96.33%±13.65%、30.67%±5.86%、45.24%±8.89%、72.81%±6.62%、90.67%±12.66%，5 组差异有统计学意义（F= 24.57，P＜0.01），SLE-exo 组低于 Con-exo 组（t= 8.06，P＜0.001）、SLE-exo+ 姜黄素5 μmol/L 组（t=5.08，P＜0.001）和SLE-exo + 姜黄素20 μmol/L 组（t= 7.38，P＜ 0.001），随着姜黄素浓度增加，CD14 水平有升高的趋势。见图5。

讨 论

单核/巨噬细胞的功能受损在SLE 的发病中发挥重要作用，可以表现为单核/巨噬细胞IL-1β分泌下降，CD80、主要组织相容性复合体Ⅱ（MHCⅡ）表达下降等，而吞噬功能的下降是其经典表现之一[10]。本研究发现，SLE患者外泌体能明显抑制巨噬细胞吞噬功能并下调巨噬细胞CD14 表达，而姜黄素可逆转SLE 患者外泌体的作用。外泌体是由细胞分泌的直径约为30 ～120 nm 的小囊泡，广泛存在于多种体液包括血液中。RNA 及蛋白可被包裹于外泌体中，避免被降解。血清中外泌体能有效地发挥细胞间信号传导的作用，外泌体上整合素、细胞间黏附分子1 和MHCⅡ等分子可能参与外泌体的靶向选择[11]。研究发现，SLE血清外泌体可使外周血单个核细胞炎症因子（包括α 干扰素、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6）分泌增多，而去除外泌体后的血清无上述作用，血清外泌体的水平与SLE 患者的疾病活动呈正相关[5]。本研究也发现，活动期SLE患者组外泌体数量多于健康对照组，并且SLE血清外泌体可能通过抑制巨噬细胞的吞噬功能，参与SLE的发病。

近期研究发现，姜黄素亦能通过调节免疫细胞的功能，对多发性硬化、炎症性肠病、类风湿性关节炎等自身免疫异常相关的疾病有治疗作用[12]，但目前缺乏SLE的相关研究。本研究发现，姜黄素能够逆转SLE 患者血清外泌体对巨噬细胞吞噬功能的抑制作用。另外，有研究称，CD14是巨噬细胞吞噬并清除凋亡细胞的关键分子[13]。本研究亦发现，SLE 外泌体可下调巨噬细胞CD14 的表达，且该作用可被姜黄素逆转。

图5 健康对照组外泌体（Con-exo）、系统性红斑狼疮患者（SLE-exo）外泌体、SLE患者组外泌体与1、5、20 μmol/L姜黄素刺激巨噬细胞后CD14蛋白电泳图；5B：5组细胞CD14蛋白水平统计图

综上所述，本研究发现姜黄素可逆转SLE外泌体对巨噬细胞吞噬功能的抑制作用，并上调巨噬细胞CD14的表达。上述结果为姜黄素作为SLE的治疗药物提供了有价值的线索，但仍需大量进一步研究的支持。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突