新疆南疆某牛场牛副结核流行病学调查研究

穆拉提·阿不都米吉提 石长青 吴建勇 朱广艺 王廷龙 胡建军*

（1塔里木大学动物科学学院，新疆阿拉尔843300）（2新疆畜牧科学院兽医研究所，新疆乌鲁木齐830000）

副结核病（Paratuberculosis）是由禽分枝杆菌副结核亚种（Mycobactrium avium subsp.paratuberculosis，MAP）引起的一种慢性传染病。犊牛感染后通常会有2～5年的亚临床感染期，期间动物机体日渐消瘦，体重下降、营养不良，发生低蛋白血症，导致感染牛跛行、乳房炎、消化道和呼吸道疾病发病率高出1～5倍［1,2]。感染牛作为传染源，间歇性向外通过粪便排菌，增加其他牛暴露风险。因此定期检测、早期发现牛副结核对规模化牛场的防控、净化具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 样品的处理

1.1.1 血样的采集与处理

以“95%的置信区间，50%最大预计流行率”为原则的抽样策略，采集新疆南疆某牛场2年龄以上泌乳牛血清样品80份，-20℃保存用于副结核分枝杆菌血清抗体ELISA检测。

1.1.2 粪样的采集与处理

根据牛副结核血清抗体ELISA检测结果，采集阳性牛直肠粪便样品，放置-20℃保存用于副结核分枝杆菌的病原学检测。

1.2 主要试剂

副结核分枝杆菌抗体检测试剂盒（Mycobacterium paratuberculosis Antibody Test Kit），购 自 爱 德 士（IDEXX）北京元亨生物科技有限公司（货号：P07130-10，批号：8070）。抗酸染色染料由塔里木畜牧科技重点实验室所提供。副结核分枝杆菌（ATCCBAA-968）的阳性质粒由新疆畜牧科学院兽医研究所提供。DNA凝胶回收试剂盒、QIAamp®DNA Stool Mini Kit、2×Taq PCR MasterMix、D2000 Marker均购于天根生化科技（北京）有限公司。扩增所用副结核分枝杆菌IS900引物序列鉴定引物序列参考Moss等［3]。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 副结核分枝杆菌IS900分子鉴定引物序列

亚型扩增所用副结核分枝杆菌DMC529、DMC531、DMC533引物序列其参考Collins等［4]。

表2 副结核分枝杆菌DMC亚型分子鉴定引物序列

1.3 仪器

多功能全波长96孔酶标仪（Synergy H1/美国BioTek公司）。PCR仪（TC-5000，英国TECHNE公司），小型高速冷冻离心机（Centrifuge 5415R，Eppendorf公司），电泳仪（Thermal cycler Block，Thermo Fisher公司），凝集成像仪（Gel DocTM XR+，Bio-RAD公司）。

1.4 副结核分支杆菌参考菌株序列

本研究中涉及的细菌参考株序列均下载于NCBI中GenBank，见表3。

表3 参考菌株

续上表

1.5 方法

1.5.1 牛副结核分枝杆菌血清抗体ELISA检测

按照副结核分枝杆菌抗体ELISA检测试剂盒（爱德士北京元亨生物科技有限公司）操作说明书，对采集的80份奶牛血清样品进行检测。

1.5.2 抗酸性染色

称取副结核分枝杆菌血清抗体ELISA检测阳性牛直肠粪便样品200 g，加入0.5%NaOH溶液，在55℃条件下水浴30 min。四层纱布过滤，除去杂物，取滤液加入2 ml离心管，12 000 rpm/min速度离心5min。弃去上清，富集沉淀物，取少量沉淀物在玻片中心5 mm×2.5 mm范围内进行涂片，用萋-尼抗酸染色法进行染色镜检。

1.5.3 PCR鉴定

按照QIAamp®DNA Stool Mini Kit说明书，取富集沉淀物进行DNA的提取。IS900基因PCR扩增程序：95℃ 预变性5 min；95℃ 变性40 s、58℃ 退火40 s、72℃延伸70 s，30个循环；72℃延伸10 min；亚型分型PCR扩增程序：95℃预变性5 min；95℃变性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s，30个循环；72℃延伸10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪中观察目的片段。扩增产物经胶回收，测序，分析。

2 结果

2.1 牛副结核分枝杆菌血清抗体ELISA检测结果

80份血清样品经牛副结核血清抗体ELISA检测，其中4份为阳性样品，阳性率为5.0%（95%置信区间CI，1.38%～12.31%）。根据试验结果，采集副结核分枝杆菌血清抗体ELISA检测阳性牛直肠粪便样品，分别标记8T、8U、8V、8W，如1.1.2所述处理。

2.2 抗酸染色结果

已采集的副结核分枝杆菌血清抗体ELISA检测阳性牛直肠粪便样品，经抗酸性染色镜检，可见背景及其它细胞为蓝色，有呈红色的短杆状菌体。见图1。

图1 粪便样品抗酸染色 10×100

2.3 IS900基因PCR鉴定结果

提取经检测为副结核分枝杆菌血清抗体ELISA检测阳性牛，8T、8U、8V、8W粪便样品DNA，用副结核分枝杆菌IS900分子鉴定引物作PCR扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳，获得长度约400 bp的预期扩增片段，见图2。

图2 副结核分枝杆菌IS900基因PCR鉴定

2.4 DMC基因PCR扩增结果

采用副结核分枝杆菌亚型分型鉴定引物DMC529、DMC531、DMC533，对8T、8U、8V、8W 样品作PCR扩增、产物经1%琼脂凝胶电泳，获得长度约310 bp大小的扩增片段，见图3。

图3 副结核分枝杆菌DMC基因PCR鉴定

2.5 IS900与DMC基因核苷酸同源性比较及系统进化树构建

8T、8U、8V、8W 样品经测序，其序列相似性为100%。因此，本文只用8T样品IS900基因序列（8TMAP-IS900）与DMC基因序列（Subtype-8T）作BLAST。发现8T-MAP-IS900基因序列与Gen Bank中AF305073.1、CP005928.1、CP015495.1、CP022095.2、CP022105.1、CP033909.1、FJ775181.1、FJ775182.1、JQ837281.1等副结核分支杆菌IS900序列同源性在99%以上；Subtype-8T基因序列与Gen Bank中CP015495.1、CP022095.2、CP022105.1、CP033909.1、CP010114.1、CP021238.1、CP033688.1等副结核分支杆菌DMC序列同源性在96.00%以上，序列基本信息如表3所示。

应用DNAstar，8T-MAP-IS900序列与副结核分枝杆菌IS900参考序列进行核苷酸同源性比较分析（见表4）。结果显示，8T-MAP-IS900与JQ837281.1两者同源性为100%，与FJ775181.1、FJ775182.1序列比对，同源性分别为99.5%，99.2%，与其他序列同源性均为99.7%。

表4 8T-MAP-IS900与副结核分枝杆菌参考菌株IS900序列同源性比较

根据副结核分枝杆菌IS900基因核苷酸序列同源性比较分析，构建系统进化树，如图4所示。8TMAP-IS900与JQ837281.1、AF305073.1、CP005928.1、CP015495.1、CP022095.2、CP022105.1、CP033909.1在遗传进化上具有高度亲缘性。

应用DNAstar，Subype-8T序列与副结核分枝杆菌DMC参考序列进行核苷酸同源性比较分析（见表5）。 结 果 显 示 ，Subtype-8T 与 CP010114.1、CP015495.1、CP022095.2、CP022105.1、CP033909.1等序列同源性均为99.4%。

图4 副结核分枝杆菌IS900基因系统进化树

表5 Subtype-8T与副结核分枝杆菌参考菌株DMC序列同源性比较

根据Subtype-8T副结核分枝杆菌DMC基因核苷酸序列同源性比较分析，构建系统进化树，如图5所 示 。 Subtype-8T 与 CP010114.1、CP015495.1、CP022095.2、CP022105.1、CP033909.1等序列在遗传进化上具有高度亲缘性。

图5 副结核分枝杆菌DMC基因系统进化树

3 讨论

根据我国近年报道，从2012年至今已有3个直辖市，5个自治区，10个省份已报道检出牛副结核病，其中包括山东（29.34%）［5]、内蒙古（14.1%）［6]、安徽（8.0%）［7]、河南（5.63%）［8]、宁夏（4.29%）［9]等地区。孙雨等对2014-2015年对来自新疆的部分牛血清样品进行了血清学流行病学调查，发现阳性率为2.2%［10]，本试验以预计流行率的抽样策略，共检测80份2年龄以上泌乳牛血清样品，检出4份阳性血清，该场牛副结核阳性率为5.0%，与孙雨等报道相比高出近两倍。牛副结核亚临床期长，不易引起兽医与饲养人员的注意和关注，该病是长期营养消耗的慢性传染病，亚临床期具有不定期排菌、不易表现临床症状等特点，净化较困难，在市场上目前针对该病尚无特效药或有效疫苗，因此感染将会对奶牛场带来严重的经济损失。

应用分子生物学技术于副结核分枝杆菌，可快速获得准确的诊断或鉴定结果，由于副结核分枝杆菌存在遗传异质性，根据培养特性和致病力分为Ⅰ（羊）型，Ⅱ（牛）型及Ⅲ（生物中间）型。本试验测序获得的8T-MAP-IS900序列与Subtype-8T序列基因比对结果，与 CP015495.1、CP022095.2、CP022105.1、CP033909.1等参考菌株的IS900序列同源性均为99.7%、DMC序列同源性为99.4%，从而确定该场存在Ⅱ型副结核分枝杆菌的感染。

吴建勇［11]在2016年报道新疆一些牛场地区存在Ⅱ（牛）型副结核分枝杆菌，2018年高建鹏［12]等所报道新疆北疆某规模化牛场也存在Ⅱ（牛）型副结核分枝杆菌。Ⅱ（牛）型副结核分枝杆不仅感染牛也存在马鹿感染的情况，王娜等报道，新疆地区马鹿也有Ⅱ型副结核分枝杆菌感染的情况［13]。本试验通过血清学检测，细菌学萋-尼氏抗酸染色镜检，PCR扩增IS900基因及亚型基因鉴定并分析，证实在新疆南疆地区某牛场中存在Ⅱ（牛）型副结核分枝杆菌感染。根据本试验通过对新疆南疆某牛场牛副结核流行病学调查结果，目前新疆地区牛副结核存在感染的情况，为防止进一步感染传播，应尽早引起关注。

牛副结核主要通过误食带菌污染粪便及饲草料而传播，隔离是控制该病的有效措施之一。根据Malinee等［14]报道，严格进行每年血清学检测与隔离，减少犊牛与阳性群的接触，可有效防制该病。ELISA检测技术具有高效、快速、经济的特点，敏感性、特异性高的优点，能快速筛查牛群中是否存在牛副结核感染，但在检测过程中需要特别注意的是2年龄前的育成牛或者处于早期感染的牛易出现假阴性结果，因此，在检测时要特别注意奶牛年龄的选择以及检测试剂盒的敏感性、特异性。

通过本试验对牛副结核病的病原鉴定及基因分型分析，为新疆南疆地区牛场牛副结核的病原学研究、流行病学调查提供了重要的参考数据，为开展牛副结核病防控、净化提供了理论依据。