适配体功能化Au@pNTP@SiO2表面增强拉曼探针的制备及用于胶带转移潜指纹的拉曼成像研究

周洋洋 杜玉梅 卞晓军 颜娟

摘 要 合成了核壳结构的表面增强拉曼散射（Surface-Enhanced Raman Scattering， SERS）探针， 用于大型客体及曲面客体表面的潜指纹成像。以对硝基苯硫酚 （4-Nitrothiophenol，  pNTP） 为拉曼小分子， 修饰在纳米金表面， 然后在其表面覆盖一层SiO2壳层， 制备Au@ pNTP@SiO2核壳纳米结构， 经溶菌酶适配体功能化修饰制得SERS探针。对探针结构进行透射电镜（TEM）、能量色散光谱（EDS）和SERS增强效应的测试， 然后将探针与不同客体表面的老化潜指纹进行孵育， 使SERS探针与指纹嵴线中的溶菌酶结合， 用透明胶带转移指纹， 采用共聚焦拉曼显微镜进行SERS信号的检测、成像。结果表明， 核壳SERS探针粒径分布均一， 多集中于～60 nm， 具有优良的稳定性和分散性; SERS增强效应显著， 其信号强度高、重现性好， 并且在723、855、1081、1343 和1572 cm1处具有显著的特征峰。将SERS探针用于胶带潜指纹成像时， 不仅可呈现指纹的一级结构（图案）， 而且指纹的二级结构（细节）如嵴中断、叉等结构也清晰可见。本研究发展的适配体功能化的SERS探针结合胶带转移潜指纹的指纹识别策略， 为法医学领域提供了一种有效的潜指纹识别方法， 并在食品安全等公共安全检测领域具有潜在应用价值。

关键词 表面增强拉曼光谱探针; 核壳纳米结构; 潜指纹; 拉曼成像

1 引 言

指纹因具有特异性和稳定性的特点， 在犯罪现场调查中发挥了重要作用[1，2]。犯罪现场的残留指纹除了目视即可看见的明显纹、手接触柔软物质留下的成型纹外， 还有一些肉眼不可见的潜指纹。潜指纹是法医最常接触到的指纹， 手接触身体分泌物（如汗液或油脂）再接触物体表面留下的指纹即为潜指纹[3， 4]。选择合适的方法增强潜指纹图谱的成像效果， 对于实际的法医鉴定具有重要意义。通常， 指纹的特征包括图案、细节和精细结构3个等级， 一级结构即图案包括常见的斗型指纹和簸箕型指纹， 二级结构细节是指纹线的一些交叉、中断等结构， 除此之外， 指纹的嵴线上分布着很多汗孔， 为指纹的三级结构。对于犯罪现场的一些残缺无法得到完整图案的指纹， 通过指纹细节确定身份至关重要; 其次， 随着网络化运行的指纹系统的健全， 指纹识别在社会服务领域、经济活动、社会管理， 甚至医疗诊断等方面也具有应用价值[5]。社会服务方面， 公民选举中， 运用指纹鉴别手段， 可有效杜绝重复投票等现象; 金融方面， 可以使用银行指纹密码箱; 安全防范方面， 重要场所、保密机构及住宅利用指纹识别可有效防止非法进入。然而， 多数可视化方法对于指纹成像基底选择性、通用性较差， 对于一些大型不可移动客体表面或曲面的指纹成像具有较大的挑战， 因此， 发展高分辨、普适化的指纹转移成像技术， 以实现大型不可移动客体表面及曲面潜指纹的细节和精细结构的识别具有重要的现实需求和意义。

目前， 根据客体的不同， 潜指纹显现方法可分为非渗透性、渗透性、半渗透性及多种客体表面的综合显现法[6]， 对于非渗透性客体表面的潜在指纹的显现方法有光学显现法、粉末显现法、502胶显现法。渗透性客体表面潜指纹显现方法主要有茚三酮显现法和物理显影液显现法， 但显影液试剂具有易污染、价格昂贵、耗时久、工作液使用寿命短、对检材破坏性较强等缺点。由于半渗透性客体上潜在手印的显现较难处理， 通常使用几种显现技术的结合， 按照最佳的显现程序进行， 常见的熏显法、多金属沉积法作为适用于多种客体表面的综合显现法被广泛使用。近年来， 随着现代仪器分析技术的发展， 越来越多的新仪器被用于潜指纹的显现[7，8]， 如荧光可视化[9～13]、场致发光法[14，15]、电化学发光法[16～19]和多金属沉积法[20～23]等， 极大地提高了潜指纹显现的灵敏度。另外， 质谱法[24～27]在对潜指纹成像的同时， 可得到潜指纹中特定化合物的详细化学信息， 但由于其局限于实验室使用， 且仪器复杂， 操作繁琐， 不适合现场调查检验。

表面增强拉曼散射技术（Surface enhanced raman scattering，  SERS）是一种振动光谱技术， 由于其谱线宽度窄、灵敏度高、不受水分子干扰及对检测体系的非破坏性特点， 被广泛用于疾病诊断、分子检测、食品安全检测以及环境检测等领域[28～32]。基于SERS的潜指纹成像技术近年来备受关注[33～36]。然而， SERS技术存在信号不均一、重现性差等问题， 而核壳纳米结构的出现为有效解决该问题提出了方案。目前， SERS技术对潜指纹可视化的报道多集中于對客体表面指纹的直接可视化分析， 对于大型不可移动客体表面及曲面物体表面潜指纹的可视化具有较大的挑战， 因此， 基于界面转移的潜指纹成像方法开始受到关注[34，37，38]， 如Zhao等[34，35]使用聚多巴胺（PDA）膜包覆聚二甲基硅氧烷（PDMS）及等离子体银纳米颗粒（AgNPs@PDA@PDMS）， 覆盖具有潜指纹的客体表面， 同时实现潜指纹转移与成像。然而， PDMS的制作成本较高， 制作工艺也较为复杂， 不适于日常使用。

寡核苷酸适配体是通过体外选择技术， 即指数富集的配体系统进化技术（SELEX）筛选出来的对靶标具有特异性的单链寡核苷酸， 与抗原抗体相比， 适配体具有更高的生物稳定性[39，40]。人体汗液中有四百余种多肽， 溶菌酶即为其一， 且在指纹嵴线中大量分布， 其适配体已被成功筛选出来[41，42]。本研究使用常见透明胶带转移潜指纹， 并与SERS成像技术和适配体识别技术相结合， 实现大型客体表面及曲面客体表面潜指纹的可视化。利用壳层隔离纳米颗粒合成方法制备对硝基苯硫酚嵌入的金-二氧化硅-核壳纳米结构（Au@pNTP@SiO2）， 对硝基苯硫酚（4-Nitrothiophenol，  pNTP）分子嵌于金核与二氧化硅壳层中间， 溶菌酶适配体作为核酸识别序列， 组装在核壳结构表面， 制得对溶菌酶有特异性识别作用的SERS探针。探针与指纹孵育， 并使用胶带将指纹连带修饰的SERS探针轻轻转移至胶带表面， 被转移后的潜指纹可在共聚焦拉曼显微镜下， 以拉曼信号分子pNTP的特征峰（1350 cm1）进行检测成像。探针合成以及检测示意图见图1。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

JEM-2010透射电子显微镜（日本电子公司）; 恒温磁力搅拌器 （上海司乐仪器有限公司）; UV-2540紫外可见分光光度计 （日本岛津公司）; XploRA共聚焦拉曼显微镜（法国Horiba公司）

四氯金酸水合物（HAuCl4·H2O， 百灵威科技公司）; 柠檬酸三钠（Na3C6H5O7·2H2O）、乙腈和乙醇（国药集团化学试剂有限公司）; 对硝基苯硫酚（pNTP）、3-氨基丙基三甲氧基硅烷（APTMS）和硅酸鈉溶液（美国Sigma-Aldrich 公司）。溶菌酶适配体序列5'-NH2-TTTTTTATCAGGGCTAAAGAGTG-CAGAGTTACTTAG-3'由生工生物工程有限公司合成。所有化学试剂均为分析纯或更高， 实验用水均为超纯水。

2.2 实验方法

2.2.1 Au@pNTP@SiO2 SERS探针的制备 参照Frens方法[43]合成60 nm的纳米金颗粒。首先， 取613 μL 1% 四水合氯金酸溶液加入到盛有50 mL水的圆底烧瓶中， 加热回流至沸腾， 在剧烈搅拌的情况下加入0.5 mL新鲜配制的的柠檬酸三钠溶液（1%）， 反应至颜色变红， 停止加热， 冷却至室温。在纳米金颗粒溶液中加入300 μL 对硝基苯硫酚乙醇溶液（1 mmol/L）， 搅拌反应4 h。取600 μL APTMS溶液（1 mmol/L）加入到50 mL上述pNTP包裹的纳米金颗粒溶液中， 室温反应 30 min， 加入4.8 mL 0.54%硅酸钠溶液， 90℃油浴反应30 min， 快速将圆底烧瓶于冰水浴中终止反应。待冷却至室温后， 再加入300 μL 1mmol/L APTMS溶液搅拌反应15 min， 备用。

2.2.2 溶菌酶适配体在Au@pNTP@SiO2表面的修饰 将制备的纳米结构（Au@pNTP@SiO2）用乙醇和乙腈分别离心清洗3～4次后， 加入乙腈复溶。加入3 mL 1 mmol/L 三聚氰酰氯乙腈溶液， 室温反应4 h。活化后的纳米结构用乙腈和乙醇离心清洗3次， 用2 mL硼酸盐缓冲液（pH 8.4）复溶。将56 μL溶菌酶适配体（100 μmol/L）溶于300 μL硼酸盐缓冲液中， 再加入上述活化后的纳米结构溶液中， 于室温下轻微振荡过夜。最后， 将反应后的混合溶液离心清洗2～3次， 并用水复溶， 于4℃保存， 备用。

2.2.3 胶带转移潜指纹的收集 志愿者首先用肥皂将手洗净并干燥， 戴一次性PE手套至微微出汗， 摘下手套将指纹按压在事先清洗干净的玻片表面。待指纹老化16 h后， 取溶菌酶适配体修饰的SERS探针滴到玻片上指纹表面， 于室温下孵育30 min， 然后用去离子水轻轻冲洗掉未识别的SERS探针。待孵育探针的指纹完全干燥后， 用透明胶带轻轻覆盖， 并按压玻璃基底表面的指纹， 将孵育了探针的指纹完全转移并粘附于胶带上。

2.2.4 胶带转移潜指纹的拉曼成像 胶带上粘附的指纹应用Horiba XploRA共聚焦拉曼光谱仪的拉曼成像系统进行成像， 10×物镜用于采集数据， 每个光谱数据收集时间为0.1 s。光谱记录范围为1200～1500 cm1， 并用1350 cm1处特征峰进行拉曼成像， 数据点采集步长为20 μm。

3 结果与讨论

3.1 Au@pNTP@SiO2 SERS探针的合成与表征

首先， 根据经典的Frens方法[43]合成纳米金颗粒， 然后通过金硫键相互作用连接对硝基苯硫酚与纳米金颗粒， 使得纳米金表面修饰上一层对硝基苯硫酚， 作为拉曼信号分子; 然后， 采用壳层隔离纳米颗粒合成方法在其表面包覆一层超薄的SiO2层形成纳米结构。对所制备Au@pNTP@SiO2纳米结构进行表征。如图2A所示， 合成的金纳米粒子的形貌较为均一， 分散性较好; 通过对透射电镜图片中的颗粒进行尺寸的统计， 金纳米颗粒的尺寸为（62.75±10）nm（图2B）。 Au@pNTP@SiO2的透射电镜图如图2C所示， 纳米金核被一层亮的圆环均匀包裹， 说明纳米金核表面成功包裹了一层均匀密闭的纳米结构， 厚度约为2 nm。EDS表征结果如图2D所示， 在Au@pNTP@SiO2纳米结构中存在硅元素， 说明纳米金核表面包覆了SiO2， 可有效避免外界环境的干扰， 确保了SERS信号的重现性和稳定性; 同时， SiO2壳层为溶菌酶适配体的修饰提供了充足的位点， 大大提高了指纹识别的效率。

通过在纳米结构表面修饰溶菌酶适配体以制备对指纹嵴线上分布的溶菌酶具有识别能力的SERS探针， 并对SERS探针的拉曼光谱特性进行了考察， 结果如图3A所示。修饰pNTP的纳米金颗粒的SERS光谱（黑色线）、Au@pNTP@SiO2纳米结构的SERS光谱（红色线）及修饰了适配体的SERS纳米探针的SERS光谱（深蓝色）均具有明显的拉曼增强效应。结果表明， 经SiO2包覆以及溶菌酶适配体的组装， 纳米金表面的拉曼小分子的SERS信号并未受到影响， 说明包覆的SiO2层厚度（2 nm）适合; 过厚的SiO2会影响激光从壳层传递到金核的效率， 进而影响SERS效应。并且， 在图3A中， pNTP在723、855、1081、1343和1572 cm1处具有明显的特征峰， 与文献[33，44]报道一致。这几处特征峰分别对应CS伸缩振动、CH摇摆振动、CS伸缩振动、ONO伸缩振动以及苯环的振动模式。同时， 在100 s内随机选取了10个点进行了拉曼光谱的收集， 所得光谱如图3B所示， 表明此核壳结构具有稳定且重现性良好的SERS信号， 并且增强效应明显。

3.2 胶带转移Au@pNTP@SiO2 SERS探针修饰潜指纹的SERS成像性能考察

进一步对SERS探针与指纹中溶菌酶的识别能力进行了验证。依照2.2.3节的方法， 在玻璃基底表面按压指纹。由于犯罪现场的多数指纹为放置的老化指纹， 因此， 本研究将采集的新鲜指纹自然放置16 h进行老化后， 与SERS探针孵育30 min， 去离子水轻轻冲洗掉多余的未键合SERS探针， 自然晾干， 于光学显微镜下进行观察。如图4A所示， 未孵育探针时， 玻璃基底表面只有残留在指纹线的灰尘， 无完整指纹纹路; 而孵育探针后（图4B及图5A）， 可见清晰指纹纹路， 并有大量颗粒状物沉积于指纹的嵴线上（黑色箭头）， 峪线上（白色箭头）则无明显的探针颗粒。溶菌酶在指纹的嵴线中大量分布， 孵育后， SERS探针与指纹嵴线上分布的溶菌酶结合， 大量沉积于指纹嵴线的表面， 而未特异性结合的峪线上的SERS探针则在冲洗的过程中被洗掉， 此结果说明， SERS探针具有良好的特异性和较高的识别效率。

用透明胶带将键合了SERS探针的指纹轻轻揭下， 使键合了纳米探针的指纹转移于胶带的表面， 于共聚焦拉曼显微镜下进行拉曼检测、成像。如图5所示， 位于1350 cm1的pNTP的拉曼特征峰最为显著， 因此， 选择此处特征峰的信号值对潜指纹进行检测和成像分析。

比较了指纹的光学成像和拉曼成像的清晰度。如图5A所示， 孵育探针后的指纹在光学成像下指纹图案不清晰， 只能看出大致形状; 图5B为胶带转移后的玻璃表面的指纹SERS成像图， 黑色的基底与红颜色的拉曼信号鲜明对比， 可清晰地看到指纹的图案， 并且指纹的二级结构如嵴中断、叉等也清晰可见。

此外， 结合法医勘察现场时可能的情况， 对桌面、塑料制品这两种客体表面按压指纹， 并用胶带转移潜指纹进行SERS成像分析。图5C为实验室桌面上按压指纹孵育探针后转移至胶带表面后的拉曼成像， 可见清晰的指纹图案， 指纹的嵴中断、叉等二级结构也清晰可见， 实验台表面未经清洁洗净以及未进行任何前处理， 说明此成像技术在成像过程中不会受到灰尘等外来污染物的干扰; 而塑料包装袋表面的指纹经胶带转移成像（图5D）中， 可见指纹一级结构、部分二级结构以及三级结构汗孔; 如图5E中（ⅰ～ⅲ）所示， 图 5D中指纹图像的部分放大图（黄色圆框所示位置）， 指纹的一级结构， 即指纹线图案; 叉、环点二级细节结构; 指纹线上三级结构即汗孔都清晰可见。由此可见， 无论玻璃、桌面、塑料制品表面， 本方法都可实现潜指纹的清晰成像， 具有很好的普适性。

SERS信号的均一性和重复性在高SERS效应纳米探针合成以及应用于拉曼成像过程中至关重要。在指纹成像过程中随机选择16处不同位置采点进行拉曼测试并作图， 结果如圖5E所示， 不同位置的SERS信号强度差异性较小， 具有良好的均一性。图5B中红色指纹线的亮度也较为一致， 表明所制备的探针可显示高效、均一的增强信号。同时， 图中残缺的指纹显现是由于客体表面的指纹本就为残缺指纹， 并非是该成像方法所致。当用胶带进行指纹采集时需轻轻按压， 将胶带完全粘附于指纹表面再轻轻揭下， 大力刮擦则极可能破坏指纹的完整性。如图5B右半部分所示（蓝色框区域）， 由于大力刮擦导致胶带上的指纹模糊成一片而无法进行清晰成像。此时， 可将另一片胶带覆盖在指纹上， 并轻轻按压， 通过两片透明胶带的相互黏附， 不仅能防止指纹不慎粘至其它基底而被破坏， 也便于采集至胶带上指纹的长久保存。

4 结 论

针对法医学检测领域中存在的大型不可移动客体表面以及曲面客体表面的潜指纹识别问题， 发展了一种基于核壳SERS探针的胶带转移潜指纹的拉曼成像策略， 并成功实现了不同客体表面潜指纹的转移及成像。通过溶菌酶适配体修饰的Au@pNTP@SiO2 核壳纳米结构与客体表面的指纹进行孵育自然晾干后， 用胶带转移客体表面的SERS探针及指纹， 于共聚焦拉曼显微镜下进行指纹的显现。本方法不仅可显现指纹的图案， 还可识别至指纹的二级结构。本方法还具有以下优点：（1）Au@SiO2的核壳结构有助于隔离外界环境对拉曼小分子的SERS效应的干扰; （2）高特异性Aptamer的使用， 大大提高了探针对指纹嵴线中的溶菌酶识别效率; （3）透明胶带价格低廉、易于获得且操作简便， 只需将制备的探针滴至客体指纹表面孵育30 min晾干， 用胶带轻轻转移后即可长久保留指纹并能随时进行指纹的成像; （4）实现了一些难以处理的大型客体及曲面客体表面的潜指纹识别。本研究发展的Au@pNTP@SiO2 SERS探针用于胶带转移客体表面指纹的成像策略为潜指纹识别提供了一种简便、普适化、可识别至指纹二级结构的有效方法， 实现了大型不易移动的客体及曲面客体表面潜指纹的显现， 对法医学检测领域具有重要的意义， 同时， 通过修饰不同的适配体或抗体进行功能化可实现指纹嵴线中不同代谢物的检测， 对于非法吸毒、食品安全、公共卫生安全等领域的检测也具良好的应用前景[45，46]。

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