M2型巨噬细胞调控增生性瘢痕形成的权重基因共表达网络分析

王紫 孙婷也 陶筱婷 王昕 庄美婷 李海洲 李青峰

增生性瘢痕是皮肤组织损伤后伤口过度愈合形成的纤维增生性疾病。瘢痕的过度增生与挛缩，可导致局部畸形并产生功能障碍，是临床治疗的难题[1]。

研究表明，M2型巨噬细胞是参与增生性瘢痕形成的重要调控细胞。巨噬细胞是免疫反应、组织修复和重塑过程中发挥主要作用的免疫细胞。在慢性炎症中，持续积聚的巨噬细胞可导致组织破坏和纤维化。巨噬细胞的多能性与其表型密切相关。其中M1型为促炎表型，由Th1型细胞因子等激活后参与经典的炎症反应[2]。M2型则由Th2型细胞因子等激活，产生抗炎因子并参与组织修复、重塑、发育及再生等过程[3]。现有证据表明：①增生性瘢痕中IL-4 mRNA表达升高，是激活M2型巨噬细胞，诱导增生性瘢痕形成的重要因素[4]；②局部应用IL-4和IL-13可激活M2型巨噬细胞，从而使组织中TGF-β表达上调，通过下游Smad信号通路直接促进成纤维细胞胶原蛋白合成；③M2巨噬细胞可直接生成某些ECM（细胞外基质）成分，包括Ⅵ型胶原蛋白、纤连蛋白和βIG-H3等[5-6]。由此可见，Th2细胞因子和M2型巨噬细胞在增生性瘢痕形成中具有重要作用。目前，这一免疫应答的启动及调节机制仍未阐明，故尚无针对性的干预方法，临床治疗效果有限。

本研究拟采用加权基因共表达网络分析（WGCNA）[7]，对小鼠增生性瘢痕的全基因组表达数据GSE26390进行处理，寻找与M2型巨噬细胞、Th2细胞因子和纤维化高度相关的共表达基因模块，通过分析关键结点基因与目标基因的关联性，寻找到瘢痕形成过程中起到最关键作用的靶基因，从而为临床预防和治疗增生性瘢痕提供新的作用靶点，并为此类纤维化相关疾病的病理发生机制研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 数据来源

小鼠瘢痕的全基因组表达数据GSE26390（NCBI下载，数据来源为 Wong等的工作[8]）。

1.2 构建共表达网络

在WGCNA算法中，每一个共表达基因组代表一个邻接矩阵，邻接矩阵包含了每对节点之间的关联度，即每对基因 i和 j的相关系数为 Sij=|cor（m，n）|。算法的前提是共表达网络需服从无尺度网络分布。因此，我们对基因的相关系数进行加权处理。权重的选择标准是能使得基因间的连接服从无尺度网络分布（Scale-free networks），即连接数为 i的概率 P(i)与in成反比。

1.3 定义邻接函数

最直接的邻接函数使用硬阈值，节点之间的关联度仅有“1”或“0”两个数值。

即阈值设定为0.8，那么即便关联度为0.79的节点仍定义为不相关。为了避免损失大量信息，我们引入幂指数邻接函数，aij＝power(Sij，B)=|Sij|β（图 1）。

图1 幂指数邻接函数Fig.1 Power exponent adjacency function

1.4 构建网络模块（Module）

模块是指高度关联的共表达基因群，在WGCNA算法中即为符合高度拓扑覆盖的节点群。我们引入TOM离散度来构建分层聚类树，利用动态切割去除非必要基因，从而获得所需的基因模块组。

1.5 模块向量基因（Eigengenes）

模块向量基因代表模块内关联度最高的基因。模块向量基因可以通过对表达数据的奇异性分解得到（X=UDVT），X是指定模块的基因表达数据，V表示模块向量基因。

1.6 将模块与外部特征相关联

计算每个基因模块的特征值与外部特征的相关系数，然后利用t检验分析基因重要性，确定模块与外部特征是否相关，从而缩小基因模块，定位关键基因（Hub gene）所在模块。

1.7 模块联盟分析（Module membership，MM）和关键调控基因识别

通过计算基因i与模块内的向量基因的关联得到模块联盟：MM(i)=|cor(x(i)，ME)|。然后通过基因重要性（Gene significance）寻找模块中处于关键地位的靶基因。

2 结果

2.1 共表达网络构建

为了尽量满足无尺度网络分布前提条件，编写探索邻接矩阵权重参数取值，使参数取值1～18，计算相应的模型，选择统计量绘制图形（图2），以权重值10为相关系数的平方取值较高（达到0.8）。

图2 权重值的选择与平均关联性Fig.2 Weight value selection and average correlation

以TOM离散度来构建分层聚类树，使用动态剪切法确定基因模块后，依次计算每个模块的特征向量值，然后对模块进行聚类分析，将距离较近的模块合并成新的模块，设置高度为0.25。

小鼠瘢痕的全基因组表达数据GSE26390分析结果显示，小鼠瘢痕形成全基因组数据中共形成31个网络模块。这些模块是通过基于拓扑结构重叠的不相似性的聚类方法分析检测到的，每一个模块用一种颜色来表示（图3）。不同基因间、不同模块间的TOM 离散度不同，组成了热图（图4）。

图3 合并距离较近的模块并形成最终模块Fig.3 Merge modules closer together and form the finalmodule

图4 TOM离散度热图Fig.4 TOM discrete heat map

2.2 核心调控基因的筛选

通过进一步运算基因模块成员关系运算（Gene-module membership），获得了每个特定基因与各个模块间的关系。结合前期文献检索得到的巨噬细胞、纤维化相关基因。挑选Blue2、magenta、green4及darkmargenta模块进行进一步的模块内分析工作。其中，Blue2模块与M2型巨噬细胞及纤维化相关表型有很强的正相关性（图5）。

图5 基因模块成员关系图，各个模块与相关巨噬细胞及纤维化基因指标的关系Fig.5 Gene module membership diagram,relationship between each module and related macrophage and fibrosis gene indicators

对Blue2模块进行进一步的分析。首先，利用DAVID功能注释生物信息学芯片分析系统（DAVID Bioinformatics Resources 6.7）对Blue2模块进行富集分析（Functional Annotation Clustering），形成 169 个类聚簇，其中信号转导、胶原、组织愈合等类聚簇富集化程度较高。进一步的KEEG信号通路富集分析发现34个有统计学意义的相关信号通路，其中包括Leukocyte transendothelial migration、Fc gamma R-mediated phagocytosis、Toll-like receptor signaling 等多个免疫细胞相关信号通路（表1）。

表1 Blue2模块的KEEG通路富集分析Table 1 Functional annotation clustering of KEEG pathway in the Blue2 module

上述结果表明，Blue2模块是介导免疫细胞参与纤维化过程的主要模块，对该模块中的核心基因进行调控，作为靶向干预手段，可能对治疗瘢痕有一定作用。为此，我们在上述基础上，将基因关联性数据导入Cytoscape程序，分别对重要模块的基因作核心基因可视化分析。通过比较模块内连通性和基因重要性可以找到一些免疫调控瘢痕的关键基因。在模块中与其他基因关联性越多的基因，往往在模块中的作用越重要。通过Cytoscape对基因间关联性和模块内基因重要性的筛选，确定以下8个基因为起到关键作用的核心调控基因：CLEC4A、CYBA、LOXL2、Hcvn1、NCKAP1L、PRRX2、LGALS9、CMTM3（图 6）。

图6 Blue2模块中的核心基因可视化分析及相互关系Fig.6 Visualization analysis and correlation of core genes in the Blue2 module

3 讨论

增生性瘢痕是一种发生于皮肤的纤维增生性疾病，涉及多种细胞、细胞因子及信号通路，发病机制仍未明确。以往病理学研究多以单个基因或蛋白为靶点，仅能帮助明确疾病发病机制的局部，难以从整体进行系统分析研究。权重基因共表达网络分析（WGCNA）可寻找协同表达的基因模块，并探索基因网络与关注表型之间的关联性。利用高通量的微阵列技术，应用基因表达芯片得到实验数据，从转录（mRNA）水平探索基因网与疾病或者研究者关注的性状之间的关系[9]。利用WGCNA，我们可应对复杂数据的归纳整理，进而用于关联性状研究、代谢通路建模、基因互作网络构建等。研究中，通过权重基因共表达网络分析（WGCNA）处理小鼠增生性瘢痕的全基因组表达数据GSE26390，识别出与M2型巨噬细胞、Th2细胞因子以及纤维化高度相关的共表达基因模块。随后运用分析关键结点基因与目标基因关联性，找到瘢痕形成过程中的8个核心调控基因：CLEC4A、CYBA、LOXL2、Hcvn1、NCKAP1L、PRRX2、LGALS9、CMTM3。

CLEC4A基因是C型凝集素/C型凝集素样（CTL/CTLD）超家族的成员，其编码蛋白存在于树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞和粒细胞中[10]。研究发现，其组成与巨噬细胞凝集素高度同源，可能参与了巨噬细胞抗原的提呈过程[11-12]。CYBA基因编码细胞色素的轻链（α链）蛋白，是NADPH酶的重要组成部分[13-14]，而NADPH的氧化是吞噬细胞免疫反应的初步过程。吞噬细胞通过利用氧化应激过程中产生的活性氧（ROC）杀死外来物质，完成相关免疫过程。当CYBA基因发生突变时，可导致ROS水平升高，从而引起一系列免疫相关疾病，如慢性肉芽肿性疾病等[15]。LOXL2（赖氨酸氧化酶样蛋白-2）是赖氨酰氧化酶家族（LOXs）的成员之一，其他成员包括 LOX、LOXL-1、LOXL-3、LOXL-4，能催化胶原及弹力蛋白的交联，使其成为不可溶的纤维，对形成正常的细胞外基质形态和完成组织修复有极其重要的作用[16]。研究认为，LOXs在肿瘤抑制及转移、细胞增殖和细胞趋化中扮演重要作用，也参与了肝脏、肺等脏器的纤维化过程[17-18]。电压门控质子通道-1（Hydrogen voltage gated channel 1，Hvcn1）的作用非常广泛，包括调节气道PH、嗜碱性粒细胞释放组胺等[19-20]，有证据表明，在吞噬细胞中，Hvcn1释放氢离子或将其聚集在吞噬小体内可代偿细胞代谢过程中产生的大量超氧化胺，从而保持细胞的活性和吞噬功能[21-22]。 Nck 相关蛋白-1（NCKAP1），编码的蛋白也称造血蛋白1（HEM1），HEM1是Scar/WAVE复合体的一部分[23]。在免疫应答中活化的Rac（属于Rho-GTPase家族）激动细胞骨架F-actin的聚集，Scar/WAVE复合体在其中起信号传递的作用，因此，HEM-1是Rac的效应蛋白[24]。研究认为，HEM-1可能参与了免疫细胞黏附、趋化和吞噬过程中细胞骨架的重塑过程，阻断该通路上的蛋白会导致免疫功能缺陷[25]。PRRX2是编码表达一组DNA相关的人类同源蛋白质（Homeobox）的转录调控基因，参与调节胎儿成纤维细胞的增殖、胎儿和成人皮肤生发层细胞的增殖。相关研究表明，人类皮肤创伤后，在胎儿时期，PRRX2可上调该类蛋白的表达，促进皮肤无瘢痕愈合，并只局限在伤口周围组织；而在成人时期，PRRX2在皮肤瘢痕愈合调节中呈弱表达[26]。LGALS9（Lectin galactoside-binding soluble 9），该基因编码的蛋白是一种可溶于水的S型半乳糖凝素。研究表明，LGLAS9编码表达的Galectin-9可通过多种途径参与调节T细胞免疫反应[27]。而CMTM3（CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing 3）基因是趋化因子样基因超家族（Chemokine-like factor gene superfamily）中的一员。在免疫系统方面，CMTM3基因不仅高表达于外周血中B淋巴细胞，也高表达于富含B细胞的脾脏中，可能影响B细胞的分化成熟及免疫功能；同时也高表达于CD4+T细胞及单核细胞中，可能对免疫系统的调节发挥作用[28]。

因此，M2型巨噬细胞和Th2型细胞因子通过上述8个核心调控基因，可能经由多种途径促进组织胶原蛋白合成及纤维化：激活的M2型巨噬细胞使组织中TGF-β表达上调，通过下游Smad信号通路直接促进成纤维细胞胶原蛋白合成[29]；活化的M2型巨噬细胞合成及成纤维细胞迁移过程中产生纤连蛋白等细胞外基质成分，促进纤维化进程[30]；在M2型巨噬细胞占优势的组织中，精氨酸酶活性强于诱导型一氧化氮合酶系统，从而促进胶原蛋白合成及细胞增殖，进而导致增生性瘢痕形成[31]。本研究结果为相关纤维化疾病的病理发生机制的研究及临床预防、治疗增生性瘢痕提供了新的靶点，拓宽了思路。本研究采用的全基因表达数据从小鼠增生性瘢痕皮肤中获得，而人类皮肤结构及免疫细胞的活化和浸润状态与瘢痕模型小鼠仍有差异，因此需要进一步探究这些基因在增生性瘢痕形成中的相互作用，以期更透彻地认识M2型巨噬细胞及Th2型细胞因子参与增生性瘢痕形成的过程，提高相关纤维化疾病的诊疗水平。