糖化bFGF对HUVEC体外血管化的效应研究

肖娴 黄瑶 倪鹏文 谢挺

目前,全球3.87亿糖尿病患者中，有15%的患者引发足部溃疡，每20秒就有1例糖尿病下肢溃疡患者需接受截肢治疗[1]。糖尿病导致机体病变主要通过4条途径：多元醇通路活性增高、晚期糖化终末产物（Advanced glycation end products，AGEs）形成增加、蛋白激酶 C（Protein kinase C，PKC）激活和氨基己糖通路活性增高[2]。文献表明，AGEs局部蓄积的病理效应导致皮肤微环境的改变，是糖尿病创面难愈的重要因素。在创面修复的诸多环节中，bFGF是维系皮肤组织正常代谢和创面愈合过程的重要成员。bFGF主要来源于包括内皮细胞在内的多种组织细胞，并广泛分布于人体组织，通过与受体结合，对局部组织细胞增殖、趋化，细胞外基质生成和微血管化有明显作用[3]。近年来的研究发现，bFGF在慢性溃疡和增生性瘢痕组织中的表达增多[4]；糖尿病小鼠脑脊液中，可检测出被显著糖化的bFGF[5]。这些研究结果提示，bFGF作为一种蛋白质，理论上在糖尿病皮肤组织中是可以被糖化的，生成糖化bFGF。

创面愈合时，血管内皮细胞是皮肤的主要修复细胞之一。创面正常愈合必须依靠足量、有效的血管化，血管内皮细胞通过发挥其增殖和迁移能力，对维护血管完整性、促进血管再生起重要作用。但AGEs的蓄积，抑制了内皮细胞增殖并诱导其凋亡。将葡萄糖与bFGF混合后的基质胶种植模型植入非糖尿病大鼠中，可抑制血管生成和肉芽形成[6]。bFGF糖化后发生功能异常，使其不能发挥正常的促愈效应，可能是创面难愈的重要原因之一。本实验拟制备糖化bFGF模型，了解bFGF糖化后对其主要效应细胞-血管内皮细胞生物学行为的影响，以期为糖尿病创面愈合中生长因子的相关研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

bFGF（美国 Gibco公司）；CHCA、果糖粉剂、葡萄糖-6-磷酸粉剂（美国Sigma公司）；乙腈、三氟乙酸（德国 Merck 公司）；SyncronisC18 column（美国 Thermo公司）；HUVEC、内皮细胞生长培养基（即用型）、胰蛋白酶/EDTA（0.04%/0.03%）、胰蛋白酶中和溶液（TNS）、无血清冻存液、HEPES缓冲盐溶液（德国Promocell公司）；CCK-8试剂盒（日本DOJINDO公司）；Matrigel Basement Membrane Matrix（美国Corning公司）；FITC Annexin V凋亡检测试剂盒（美国BD公司）。

Mass Standards Kit for the 5800 Proteomics Analyzer（美国 ABI公司）；5800 MALDI TOF/TOFTM Analyzer（美国 SCIEX 公司）；Ultimate 3000UHPLC（美国Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 bFGF和糖化bFGF的制备

分别用果糖和葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）制备糖化bFGF[7-8]。以下为果糖制备糖化bFGF的方法（同G-6-P制备糖化bFGF方法）。①制备0.25 M果糖溶液。将0.45 g果糖粉剂分别溶解于10 mL PBS中，震荡混匀，用0.22 μm滤器过滤备用；②制备10 μg/mL bFGF溶液。将1 mg bFGF粉剂溶解于1 mL PBS溶液中，形成1 mg/mL bFGF溶液，取出其中10 μL bFGF溶液加入990 μL PBS溶液中；③取出500 μL 0.25 M 果糖溶液和 500 μL 10 μg/mL bFGF 溶液，将其混合于1.5 mL Eppendorf管中，形成5 μg/ml糖化bFGF溶液，置于37℃、5%CO2培养箱孵育7 d。同时，另外制备5 μg/ml糖化bFGF溶液，置于37℃、5%CO2培养箱孵育48 h；④制备5 μg/mL bFGF溶液。分别取出 500 μL PBS 溶液和 500 μL 10 μg/mL bFGF 溶液，将其混合于1.5 ml Eppendorf管中。

1.2.2 质谱鉴定糖化bFGF体外模型

取制备好的糖化bFGF样品适量，使用C8StageTip柱进行盐分洗脱，上样到色谱柱的蛋白样品使用0.1%的三氟乙酸（TFA）重复冲洗多次，确保样品中盐分被充分洗脱，最后使用80%的乙晴（ACN）和0.1%TFA将蛋白洗脱下来，保存待检。

取1 μL糖化bFGF样品，直接点于样品靶上，让溶剂自然干燥，再取0.5 μL过饱和的α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）基质溶液（溶剂为 50%ACN，0.1%TFA）点至对应靶位上并自然干燥。样品靶经氮气吹净后放入仪器进靶槽并用5800串联飞行时间质谱仪进行质谱分析，激光源为355 nm波长的Nd:YAG激光器，加速电压为2.5 KV，采用正离子模式和自动获取数据的模式采集数据，质量扫描范围为800～35 000 Da。

1.2.3 色谱法分析糖化bFGF模型成分

分别取50 μL bFGF溶液和 100 μL糖化 bFGF溶液，浓缩后，用 18 μL A 液（0.1%TFA）复溶后，上样；进样量为15 μL；紫外吸收波长254 nm；流动相包括 A 液（0.1%TFA）和 B 液（CAN）液；色谱梯度：总60 min（3～30 min，5%～50%B）。

1.2.4 bFGF和糖化bFGF干预条件的确定

参考文献[8-10]方法，选择2～80 ng/mL的浓度梯度来筛选bFGF和糖化bFGF的干预浓度。利用CCK-8方法，观察两组OD值，绘制标准曲线。确定干预浓度的标准是：两组之间OD值差异最为明显。

配制 80 ng/mL、40 ng/mL、20 ng/mL、10 ng/mL、4 ng/mL、2 ng/mL的 bFGF和糖化 bFGF （表 1-2）。bFGF和糖化bFGF的初始浓度为5 μg/mL。

表1 2～80 ng/mL bFGF的配制Table 1 Preparation of 2-80 ng/mL bFGF

表2 2～80 ng/mL糖化bFGF的配制Table 2 Preparation of 2-80 ng/mL glycated bFGF

用2～80 ng/ml浓度的bFGF或糖化bFGF干预96孔板中的HUVEC，培养24 h后以CCK-8法测量OD值。

1.2.5 培养HUVEC

预先将HUVEC生长培养基（即用型）10 mL加入培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱30 min；取出细胞株后迅速置于37℃恒温水浴箱，静置2 min，吸取细胞悬液至预温过的培养液中，置于37℃、5%CO2培养箱；待细胞生长至培养瓶面积的70%～90%，即可传代。传代时弃去旧培养液，按100 μL/cm2的比例加入HEPE缓冲液，轻柔冲洗细胞15 s后弃去；然后按100 μL/cm2的比例加入EDTA （0.04%/0.03%）溶液，倒置显微镜下观察细胞状态，待80%细胞变圆后，按100 μL/cm2的比例加入胰蛋白酶中和液TNS；收集细胞悬液，220 g离心4 min，弃去上清液；加入适量内皮细胞生长培养基重悬细胞，转移至培养瓶，置于37℃、5%CO2培养箱。

1.2.6 CCK-8实验检测bFGF和糖化bFGF干预人真皮微血管内皮细胞（HUVEC）后的细胞增殖效应

将指数生长期的HUVEC用胰蛋白酶/EDTA（0.04%/0.03%）消化，按 5×103个/孔的密度接种于96孔板，每组5个副孔，置于37℃、5%CO2培养箱培养；次日，每孔用100 μL PBS溶液洗板。分别用内皮细胞培养基、20 ng/mL bFGF内皮细胞培养基、20 ng/mL糖化bFGF内皮细胞培养基刺激细胞，每孔 100 μL；分别于刺激后 1 d、3 d及 7 d后测定HUVEC的增殖活性。测定前，弃96孔板中旧培养液，每孔用100 μL PBS溶液洗板。将内皮细胞培养基和CCK-8溶液按10∶1的比例混合后，每孔加入100 μL混合液，同时设置空白孔，置于37℃、5%CO2培养箱，于2 h后用酶标仪在450 nm处读取吸光度值。实验分成3组：①空白组（0 ng/mL bFGF内皮细胞培养基）；②实验组（含有20 ng/mL糖化bFGF的内皮细胞培养基）；③对照组（含有20 ng/mL bFGF的内皮细胞培养基）。该实验重复3次。以空白组第1天OD值均数为基数，其余各时相点（含空白组第3天及第7天、实验组和对照组所有时相点）OD值除以空白组第1天OD值均数，获得细胞增殖百分数表示细胞增殖活性。

1.2.7 bFGF和糖化bFGF干预后的HUVEC血管形成能力

将Matrigel Basement Membrane Matrix置于冰盒后放入4℃冰箱过夜，同时将实验使用的48孔板和Tip头均置于4℃冰箱预冷；次日，将液化后的Matrigel Basement Membrane Matrix 按 150 μL/孔加入48孔板中，置于37℃、5%CO2培养箱30 min；将指数生长期的HUVEC用胰蛋白酶/EDTA（0.04%/0.03%）消化，待80%细胞变圆，加入胰蛋白酶中和液TNS，以220 g离心4 min，弃上清，加内皮细胞培养基重悬细胞，计数，按2×104个/孔的密度接种于已固化于48孔板的Matrigel Basement Membrane Matrix中，每组3个副孔，同时加入100 μL内皮细胞培养基、40 ng/mL bFGF内皮细胞培养基、40 ng/mL糖化bFGF内皮细胞培养基，形成终浓度为0 ng/mL、20 ng/mL bFGF和20 ng/mL糖化bFGF的刺激液，置于37℃、5%CO2培养箱，6 h后倒置显微镜观察血管样结构。实验分成3组：①空白组 （0 ng/mL bFGF内皮细胞培养基）；②实验组（含20 ng/mL糖化bFGF的内皮细胞培养基）；③对照组（含20 ng/mL bFGF的内皮细胞培养基）。实验重复3次，结果采用Image J软件分析，包括节点数量、交叉点数量、网眼数量和主干分段数量。

1.2.8 bFGF和糖化bFGF干预后HUVEC的凋亡

将指数生长期的HUVEC用胰蛋白酶/EDTA（0.04%/0.03%）消化，待80%细胞变圆，加入胰蛋白酶中和液TNS，220 g离心4 min，弃上清，加入内皮细胞培养基，重悬细胞，计数，按1×104个/孔的密度接种于6孔板，每组3个副孔，置于37℃、5%CO2培养箱培养；次日，弃原培养板中的内皮细胞培养基，每孔用1 mL PBS溶液洗板一次。分别用内皮细胞培养基、20 ng/mL bFGF内皮细胞培养基、20 ng/mL糖化bFGF内皮细胞培养基刺激细胞，每孔2 mL；分别于刺激后1 d、3 d、7 d后测定HUVEC的凋亡。测定当日，吸取6孔板中旧培养液至流式管中，每孔用1 mL PBS溶液洗板一次后，加入500 μL无EDTA胰酶，显微镜下观察细胞同时晃动6孔板，待细胞变圆漂起即用原内皮细胞培养基中止消化。轻柔吹打细胞后，将细胞悬液吸至流式管中，1 500 r/min离心5 min，弃上清并倒扣于滤纸上。将试剂盒中的10×缓冲液用PBS配制成1×工作液，每管加入60 μL工作液重悬细胞，其中空白管加入100 μL工作液用于测定细胞大小及活性。然后除空白管外，每管加入3.8 μL Annexin V试剂，室温避光10 min后，除空白管外，每管再依次加入3.8 μL PI试剂和100 μL工作液，充分混匀后，用流式细胞仪检测细胞凋亡。实验分成3组：①空白组（0 ng/mL bFGF内皮细胞培养基）；②实验组（含有20 ng/mL糖化bFGF的内皮细胞培养基）；③对照组（含有20 ng/mL bFGF的内皮细胞培养基）。该实验重复3次。

1.2.9 统计方法

2 结果

2.1 体外糖化bFGF制备

MALDI-TOF-MS分析 bFGF和糖化 bFGF，确定bFGF相对分子量为16 700 Da，而使用G-6-P孵育48 h和7 d的糖化bFGF并未找到相应分子量峰值，使用果糖孵育7 d的糖化bFGF也未找到相应峰值，仅仅发现使用果糖孵育48 h的糖化bFGF的相对分子量呈现为16 992 Da（图1）。

图1 bFGF和糖化bFGF的质谱分析图谱Fig 1 Mass spectrometry of bFGF and glycated bFGF

2.2 糖化bFGF样品的成分分析

通过MALDI-TOF-MS发现使用果糖孵育48 h的糖化bFGF能找到糖基化峰值，使用此种糖化bFGF实施高效液相色谱法，可看出在6～22 min的梯度区间内，发现多个bFGF差异色谱峰 （同水相比）；在7～22 min的梯度区间内，制备的糖化bFGF样品与bFGF相比，有着极为相似的差异色谱分；制备的糖化bFGF样品同H2O和bFGF相比，糖化bFGF在6～7 min之间出现差异色谱峰，且随样品浓度的增加，该色谱峰呈现增高的趋势（图2）。

图2 H2O、bFGF、糖化bFGF在高效液相色谱法中的差异色谱峰Fig.2 Chromatographic peaks of H2O,bFGF and glycated bFGF in HPLC

2.3 bFGF和糖化bFGF干预细胞的浓度选择

绘制标准曲线发现5×103个/孔为最佳浓度。bFGF和糖化bFGF干预24 h后，bFGF总体上似乎表现出更好的促增殖效果，在浓度为20 ng/mL时，测得两组间的OD值差异最为明显，故以20 ng/mL作为本实验的干预浓度（图3）。

图3 不同浓度的bFGF和糖化bFGF干预对HUVEC增殖的影响Fig.3 The effect of different concentrations of bFGF and glycated bFGF on the proliferation of HUVEC

2.4 bFGF与糖化bFGF对HUVEC增殖的影响

干预后第1天，对照组较空白组的细胞增殖显著增高（P＜0.01）；实验组较空白组的细胞增殖显著增高（P＜0.05）；对照组较实验组的细胞增殖显著增高（P＜0.01）（图 4）。

干预后第3天，对照组较空白组的细胞增殖显著增高（P＜0.001）；实验组与空白组的细胞增殖无显著差异（P＞0.05）；对照组较实验组的细胞增殖显著增高（P＜0.001）（图 4）。

干预后第7天，对照组较空白组的细胞增殖显著增高（P＜0.05）；实验组与空白组的细胞增殖无显著差异（P＞0.05）；对照组较实验组的细胞增殖显著增高（P＜0.001）（图 4）。

图4 CCK-8实验检测HUVEC增殖效应Fig.4 CCK-8 assay for proliferation effect of HUVEC

2.5 bFGF与糖化bFGF对HUVEC血管形成的影响

Matrigel Basement Membrane Matrix培养条件下，与空白组相比，对照组干预6 h后，可明显观察到HUVEC的管样结构形成增多，其血管形成的节点数量、交叉点数量、网眼数量、主干分段数量都具有显著统计学差异（P＜0.05）；与空白组相比，实验组的管样结构较为稀疏和不完整，血管形成的节点数量、交叉点数量、主干分段数量均显著减少（P＜0.05），网眼数量与空白组相比无显著差异（图5）。

图5 Matrigel凝胶实验检测HUVEC血管形成效应Fig.5 Matrigel gel assay for HUVEC angiogenesis

2.6 bFGF与糖化bFGF对HUVEC凋亡的影响

干预后第1、3天，实验组与对照组的细胞凋亡无显著差异（P＞0.05）；干预后第7天，实验组较对照组的细胞凋亡显著增高（P＜0.01）（图 6）。

图6 流式细胞技术检测HUVEC凋亡效应Fig.6 Flow cytometry assay for HUVEC apoptosis

3 讨论

我们选择0.25 M 果糖、G-6-P与10 μg/mL的bFGF在37℃条件下分别孵育48 h和7 d，以制备糖化bFGF。质谱显示果糖孵育48 h后，bFGF被糖化。高效液相色谱法证实糖化bFGF制备成功。

体外制备糖化蛋白已有很多报道，多种条件均可成功制备糖化蛋白。这些研究涉及不同浓度的孵育原料，孵育时间从 1 h 至 30 d 不等[5，7-8，11]。其中，生长因子糖化的孵育最长为168 h[7]。相关研究表明，果糖能够更好地与蛋白发生糖化反应[5，7]。本实验结果显示，果糖与bFGF孵育48 h，质谱显示的峰值最为明显。高效液相色谱法检测结果也给予了证实。

细胞实验中，我们对干预条件进行了筛选。结果显示，在2 ng/mL到80 ng/mL的浓度区间内，经过24 h培养，bFGF和糖化bFGF均表现出对血管内皮细胞的促增殖效应，两组在20 ng/mL浓度下OD值的差异最为明显，故我们以此作为最终干预条件。在20 ng/mL浓度bFGF和糖化bFGF条件下进行1 d的细胞培养，细胞数量均可增加，但bFGF干预后的细胞数量增加更为显著[7-8]，符合本实验的结果。

以该干预浓度，我们观察了1 d、3 d、7 d的细胞增殖、凋亡。结果显示，与空白组相比，bFGF组表现出更好的促增殖效应，糖化bFGF组仅在第1天表现出促增殖效应，其余时相点未见明显差异。在凋亡检测中，糖化bFGF组在干预后第7天的细胞凋亡较bFGF组更为明显。从总体上看，糖化bFGF在本实验条件下无促增殖效应，但也未表现出抑制细胞增殖的效应，且在一定干预时间后诱导细胞凋亡。

对于上述结果，我们认为bFGF的促增殖效应是肯定的。但糖化bFGF并未表现出对细胞增殖的负调控作用，可能是本研究制备的糖化bFGF为包含糖化与非糖化bFGF的混合物，因此当用于干预细胞时，对于细胞增殖的影响可能是一种综合效应，既包含了未糖化bFGF的促增殖效应，也包含了糖化bFGF的增殖抑制效应，最终表现为与正常培养条件相似的细胞增殖效应。但因糖化bFGF的存在，随干预时间延长，仍会表现出诱导细胞凋亡的效应。

本实验中，细胞成管效应的结果与细胞增殖有所不同。bFGF干预细胞后能促进血管形成；糖化bFGF干预后，细胞的成管明显抑制。事实上，血管内皮细胞在Matrigel培养条件下形成管样结构，不仅与细胞增殖有关，还涉及细胞迁移等其他细胞行为。这些行为与细胞骨架、细胞外基质骨架等多种复杂因素有关。文献显示，糖化蛋白与这些分子事件显著相关[12-13]。本实验所制备的糖化bFGF，不能促进细胞增殖，但理论上可负向介导与细胞迁移相关的分子事件，从而表现为抑制血管形成。

综上所述，我们用果糖与bFGF在37℃温箱中孵育48 h，成功制备出糖化bFGF。bFGF可明显促进细胞增殖，对血管形成效应也有促进作用；糖化bFGF未显示出对细胞增殖的明显作用，但对血管形成有抑制作用。本实验为后期开展生长因子糖化后受体相关事件提供了基础，也对糖尿病创面的难愈机制研究提出了新的思路。