HS-SPME-GC-MS法分析即墨黄酒陈酿过程中香气成分的变化

阎文飞 郭 瑞 朱 丹 刘 晔 裴云成，3 靳 钊 程凡升*

（1青岛农业大学食品科学与工程学院 山东青岛 266109

2青岛农业大学生命科学学院 山东青岛 266109

3青岛农研生物科技有限公司 山东青岛 266109

4青岛贞正分析仪器有限公司 山东青岛 266109）

黄酒是以稻米、黍米、玉米、小米、小麦等为主要原料，经浸泡，蒸煮，加酒曲，糖化，发酵，压榨，过滤，煎酒（除酶），贮存，勾兑而成的具有特殊色、香、味的饮料酒，是世界三大古酒之一[1-2]。黄酒营养丰富，不仅含有多种必需氨基酸，还含有醇类、酸类、脂类、羰基化合物和酚类等营养物质[3-4]。

黄酒独特的口感和香气决定了感官评价与风格鉴定结果，是衡量黄酒质量的重要因素之一。酒中挥发性物质不仅成分复杂，来源多样，还存在累加、分离以及抑制等相互作用[5-6]，在对其组分分析时需先分离和富集。常见的酒类香气成分提取技术主要有溶剂萃取、蒸馏法、顶空法 （动态或静态）、固相萃取和固相微萃取等[7]。固相微萃取是一种不需溶剂的样品前处理技术，集采样、萃取、浓缩和进样于一体，具有操作简单、快速等优点，已广泛应用于果酒[8]、葡萄酒[9]、白酒[10]、山西桂花黄酒与绍兴花雕酒[11]等香气成分分析，同时也涉及通过对黄酒的香气成分分析来鉴别、分类黄酒样品的酒龄、产地等。朱潘炜等[12]以不同年份的古越龙山绍兴黄酒的成品酒和基酒为研究对象，优化了顶空固相微萃取法的萃取条件，并分析3个年份成品黄酒的挥发性和半挥发性成分。郑春亮[13]等利用顶空固相微萃取的方法提取5种成熟期黄酒的香气成分，并用气-质联用仪对各组分进行分离、鉴定和定量。刘俊等[14]使用顶空-固相微萃取-气质连用技术建立全自动、快速测定黄酒中氨基甲酸乙酯的方法。然而，目前对于即墨黄酒香气成分的研究不多。

本研究以4种年份的即墨黄酒为研究对象，采用顶空-固相微萃取法提取酒样中的香气化学成分，考察不同萃取探针、萃取温度、萃取时间、NaCl添加量的萃取效果，确定最佳萃取条件，并用GC-MS法测定酒样中挥发性香气物质，分析不同年份酒样中挥发性香气物质的种类及相对含量，计算醇酯比，探究即墨黄酒陈酿期间香气成分的变化，为即墨黄酒香气化学成分的分析提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄酒样品由青岛某酒企提供。该黄酒采用地窖恒温发酵，坛装陈酿。选取2009年、2012年、2013年、2015年份的样品。将酒样置于纯净水瓶中，保存在4℃恒温冰箱中，现用现取。氯化钠（分析纯），中国天津市巴斯夫化工有限公司。

6890 N/5975B气相色谱-质谱联用仪，美国安捷伦科技有限公司；PDMS涂层、PDMS/DVB涂层、ACAR/PDMS/DVB涂层固相微萃取探针，青岛贞正分析仪器有限公司。

1.2 香气成分提取

于20 mL干净干燥的顶空瓶中准确加入5 mL黄酒样品，加盖密封垫和铝帽，探针以顶空方式萃取黄酒中的挥发性成分，萃取时间和温度依据试验要求具体设定，用于GC-MS分析。为延长萃取头的使用寿命，优化萃取时间和萃取温度过程中不对酒样进行磁力搅拌。第1次使用萃取探针时在气相色谱-质谱仪的进样口260℃老化1 h。

1.3 单因素优化试验

1）萃取探针的选择 取2012年份酒样5 mL置于20 mL顶空瓶中，40℃萃取30 min。比较PDMS涂层、PDMS/DVB涂层和ACAR/PDMS/DVB涂层3种萃取探针对即墨黄酒挥发性成分的萃取效果，确定最佳的萃取探针材料。

2）萃取温度的选择 使用最佳萃取探针，分别在 30，40，50，60，70 ℃下萃取 30 min，考察萃取温度对即墨黄酒香气成分的萃取效果，确定最优的萃取温度。

3）萃取时间的选择 选用最佳萃取探针，最佳萃取温度，分别萃取 15，30，45，60，75，90 min，考察萃取温度对即墨黄酒香气成分的萃取效果，确定最佳萃取时间。

4）NaCl添加量的选择 选用最佳萃取探针，最佳萃取温度，最佳萃取时间，对NaCl添加量进行优化。探究NaCl质量浓度0.00，0.05，0.10，0.15，0.20 g/mL对即墨黄酒萃取效果的影响，确定最佳NaCl添加量。

1.4 GC-MS条件及数据处理

色谱条件：DB-5MS色谱柱（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm）；手动无分流进样，进样口温度260℃；程序升温：初始温度35℃，保留3 min，以2℃/min的速率升至60℃，再以6℃/min的速率升至250℃，保留 5 min[8]；检测器温度 250℃；载气 He，流速1.2 mL/min。

质谱条件：EI电离源，离子源温度230℃；接口温度250℃；电子能量70 eV；扫描范围10～450 u；四级杆150℃。

数据处理方法：设定峰宽值为0.010，初始阀值为15。使用NIST MS数据库进行所得挥发性香气物质的谱库分析，并进行物质定性。使用Origin软件作图。

2 结果与分析

2.1 萃取头

根据乙醇和水之外挥发性香气物质的绝对峰面积和出峰个数，确定最佳萃取探针。由图1可知，使用ACAR/PDMS/DVB涂层探针萃取所得挥发性香气物质绝对峰面积最大且峰个数最多达28个，其次是PDMS/DVB涂层探针，而PDMS涂层探针最少。本试验选择ACAR/PDMS/DVB涂层探针作为主要研究工具。

萃取探针对香气物质的吸附是依据相似相溶的原理。PDMS探针萃取材质为聚二甲基硅氧烷，是非极性萃取层，适合非极性或者低极性分析物；PDMS/DVB探针萃取材质为聚二甲硅氧烷/聚二乙烯基苯，是双极性萃取层，适合中等极性至极性物质；ACAR/PDMS/DVB探针萃取材质为活性炭/聚二甲基硅氧烷/聚二乙烯基苯，是双极性萃取层，适合吸附中等极性至极性较宽范围的挥发性物质。本目标分析物成分复杂、极性各异，选用ACAR/PDMS/DVB涂层探针能更好地萃取即墨黄酒中的挥发性物质。

王培璇等[15]采用75 μm的 CAR/PDMS SPME萃取头对黄酒样品中的挥发性成分进行萃取。王洪燕等[11]优化出CAR/PDMS/DVB复合涂层的萃取探针对山西桂花黄酒的易挥发成分的萃取效果最好；王志娟等[16]优化出CAR/PDMS/DVB复合涂层的萃取探针对竹叶青酒易挥发成分萃取效果最好；CAR/PDMS/DVB复合涂层为碳分子筛/聚二甲基硅氧烷/聚二乙烯基苯涂层，与本试验选取的探针涂层相似。

2.2 萃取温度

选用ACAR/PDMS/DVB涂层探针，比较30，40，50，60，70℃ 5种萃取温度对即墨黄酒挥发性香气成分的萃取效果，结果见图2。萃取温度为50℃时萃取到的香气物质峰个数最多，绝对峰面积较大；萃取温度为30℃时，萃取到的香气物质的绝对峰面积最高，而峰个数略少。由此可见，并非萃取温度越高萃取效果越好。王志娟等[16]发现在一定温度范围内，温度升高促进易挥发成分到达顶空及萃取纤维层表面。SPME表面吸附过程一般为放热反应，温度相对较低，更适合于表面吸附萃取。在一定范围内，温度升高使酒样中的香气物质从基质中逸出，提高萃取效率；温度过高就会抑制香气物质的出峰面积，仅可检测到此香气物质。综合考虑后选取萃取温度50℃。

图1 萃取头材质对挥发性成分萃取效果的影响Fig.1 Effect of microextraction fiber type on extraction efficacy

图2 萃取温度对挥发性成分萃取效果的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on volatile extraction

李春美等[17]分析荔枝汁储存过程中香气成分时，选用萃取温度为50℃；宋海燕等[18]选用50℃萃取不同地区、不同酒龄的黄酒中的挥发性物质，与本试验结果一致。张妮等[8]优化樱桃酒的萃取温度，结果发现40℃萃取樱桃酒香气物质的效果最佳，比本试验结果低，可能是由于本试验酒样是在4℃冷藏，提取香气物质时温度稍高一些才能达到较好的提取效果。朱潘炜等[12]对古越龙山黄酒优化萃取温度时，发现60℃萃取黄酒香气物质的效果最佳。可见不同品种的黄酒萃取温度也不同。

2.3 萃取时间

选用ACAR/PDMS/DVB涂层探针，在50℃条件下萃取，比较 30，45，60，75，90 min 6 个萃取时间对即墨黄酒挥发性香气成分的萃取效果，结果见图3。随着萃取时间的增加，峰个数呈先上升后下降的趋势，这与王洪燕等[11]优化时间时峰个数的变化趋势相似，可能是由于时间过长，原本吸附在萃取头上的物质逐渐挥发所致。75 min时，萃取到香气物质的绝对峰面积最高，而峰个数较少；萃取时间为60 min时，萃取到酒样中香气物质的绝对峰面积最小，峰个数最多，同时，香气物质的绝对峰面积占总绝对峰面积的比例最高，达50.47%。从开始萃取到萃取平衡所需时间由待测组分的分配系数、样品基质和体积、香气物质的扩散速度、萃取头材质等因素决定的。经综合考虑，选取萃取时间为60 min。

李春美等[16]分析荔枝汁储存过程中香气成分时，选用萃取时间为60 min，与本试验结果一致。苏海荣等[5]对即墨妙府黄酒二年陈选用60℃预热15 min后平衡萃取30 min。刘浩等[6]萃取小米黄酒和黍米黄酒香气成分时，采用60℃预热30 min后萃取30 min。朱潘炜等[12]对古越龙山黄酒优化萃取条件为60℃萃取30 min，效果最佳。可见，不同处理温度、不同种类、不同品种的酒，萃取时间不同。

2.4 NaCl添加量

比 较 0.00，0.05，0.10，0.15，0.20 g/mL 5 个NaCl质量浓度对即墨黄酒挥发性香气成分的萃取效果，结果见图4。NaCl质量浓度为0.2 g/mL时，萃取到黄酒中香气物质的绝对峰面积最大，而峰个数较少；NaCl质量浓度为0.15 g/mL时，萃取到的香气物质峰个数最多，绝对峰面积较大。可见，萃取效果并非随着NaCl添加量的增加而呈规律性变化。经综合考虑确定添加NaCl的质量浓度为0.15 g/mL。

图3 萃取时间对挥发性成分萃取效果的影响Fig.3 Effect of extraction time on volatile extraction

图4 NaCl质量浓度对挥发性成分萃取效果的影响Fig.4 Effect of salt oncentration on volatile extraction

王志娟等[16]在研究竹叶青酒的最佳萃取条件时，优化结果为NaCl添加量0.20 g/mL。氯化钠在水中溶解度较高，可以提高溶液的离子强度，降低基体对挥发性成分的束缚作用，增大所测黄酒中有机挥发性物质的逸出活度，使吸附到萃取头上的挥发性物质更多，在盐析时可以提高吸附效果[19]。过量的NaCl会影响所测酒样中基质的黏度，降低酒体中挥发性物质的扩散速度，从而产生盐的负效应，降低提取效果。

2.5 4个年份酒样的萃取结果

比较 2009年、2012年、2013年、2015年 4个年份即墨黄酒使用最优的萃取条件和挥发性香气成分的萃取效果。从2009年、2012年、2013年、2015年黄酒中检测到挥发性香气物质的绝对峰面积分别为 1 736 892 405，724 454 449，537 670 391，1 307 091 094；检测到挥发性香气物质种类分别为 16，15，15，19。 可见，2009 年份酒样除乙醇外挥发性香气物质的绝对峰面积最高，2012年份酒样最低，不同年份的酒样所得绝对峰面积相差较大；其次，不同年份的酒样在相同萃取条件下所得出峰个数差距较小，2015年份的酒样出峰个数最多，2012年和2013年黄酒样品出峰个数相同。出峰个数并非随着年份的增长而呈规律性变化。对于不同年份的酒样需要根据优化条件具体分析。

2.6 4个年份酒样中的挥发性物质

比较 2009年、2012年、2013年、2015年 4个年份即墨黄酒使用最优的萃取条件和挥发性香气成分，结果见表1。

分析表1可知，在2009年份的黄酒样品中共检测出3种醇类物质，4种酯类物质，2种醛类物质，2种酮类物质，2种酸类物质，2种糖苷类物质，1种胺类物质。在2012年份的黄酒样品中共检测出5种醇类物质，10种酯类物质，1种醛类物质，2种烷类物质，1种酸类物质。在2013年份的黄酒样品中共检测出3种醇类物质，8种酯类物质，2种醛类物质，2种烷类物质，1种胺类物质，1种烯类物质。在2015年份的黄酒样品中共检测出3种醇类物质，13种酯类物质，1种酸类物质，3种烷类物质，1种胺类物质。2015年酒样中酯类物质种类最多达13种，2012年份酒样次之，2009年份酒样最少仅4种。

各年份酒样的醇类物质种类数差距不大。苯乙醇在各年份酒样中均有测出且峰面积均占总峰面积的6%以上，从2009年、2012年、2013年酒样看出，随着黄酒酒龄的增加，其相对含量随之减少。鲍忠定等[20]通过GC-MS技术鉴定黄酒中的香气成分，结果发现随着黄酒酒龄的增加，β-苯乙醇含量减少，与本试验结果一致，这为黄酒的选择性提供了理论基础。苯乙醇是黄酒中主要的高沸点香气成分，是一种芳香高级醇[21]，作为国家标准中黄酒检验的一项理化指标，在黄酒定量的风味化合物中，含量居前3位，在中国黄酒中具有较高的香气强度[21-22]。它淡雅、甜润、玫瑰气味的芳香，与酯醛类组分融合成协调、细腻的黄酒香气，给人以愉悦、柔和、优雅[22]和醇厚、协调[11]的感觉。主要由酵母菌生长代谢产生，酵母菌通过Ehrlich途径，利用L-苯丙氨酸经转氨酶、苯丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶作用生成苯乙醇，也可通过糖代谢途径产生[21]。除2009年份酒样外，其它年份酒样中均检测到异戊醇和异丁醇，它们是黄酒中的高级醇，醇香最为明显，是黄酒中醇香的主要来源[23]。异戊醇具有青草、植物的香气[24]，可由酵母等分解亮氨酸和异亮氨酸或氨基酸代谢生成[23]。异丁醇具有酒精味、指甲油的香味[25]。郎召伟[26]描述异丁醇为苦味、微弱戊醇味。

表1 2009、2012、2013、2015年即墨黄酒的萃取结果Table1 The extraction results of Jimo Rice Wine in 2009，2012，2013，2015 year

（续表1）

3种酯类物质在4个年份酒样中都有检出，分别是苯乙酸乙酯、苯丙酸乙酯和丁二酸二乙酯；苯乙酸乙酯具有甜水果香气，丁二酸二乙酯呈现微弱的果香气，味微甜，带涩、苦味[27]。鲍忠定[20]以绍兴加饭酒为研究对象，通过色-质谱联用结合纯标样的保留时间对组分峰的定性鉴定出42种香味化合物，其中乙醇、异戊醇、苯乙醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁二酸二乙酯、乳酸、乙酸等是构成黄酒芳香主体的来源之一。以上物质除乙酸外，都有检出，这可能是运输过程和材料准备过程使易挥发的乙酸丢失，因此未检出。

醇类与酯类是黍米黄酒主要的香气成分类别[6]。具体到香气成分来看，苯乙醇、异戊醇、丁二酸二乙酯、乙醇类物质是由糖代谢、氨基酸脱氢脱羧作用产生，是陈化酯类物质的前驱物质[27]。乳酸乙酯具有优雅的果香或酒香气味，微有脂肪气味、苦涩味，能使酒产生浓厚感[24，27]。乙酸苯乙酯具有玫瑰花香，壬酸乙酯具有葡萄的水果气味[24]，芳香带甜，二者仅在2015年酒样中检出。除2015年酒样外，其它酒样中均检测到十六烷酸乙酯，呈微弱蜡香、果爵和奶油香气。十二烷酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯仅在2015年酒样中含量较高。十二烷酸乙酯具油脂、稍带叶样和似花瓣的温和香气；辛酸乙酯具有白兰地酒香味，过程酒中含量较多，而成品酒中含量较少[28]。癸酸乙酯具有椰子香气[28]和微弱的果香[27]，在过程酒中含量较多，经后发酵所剩无几[28]。乙酸异戊酯具有香蕉气味，在前酵结束时含量达到最大，是生成很多香气物质的重要前体物质，而在成品酒中几乎没有[28]。本试验中也仅在2012年的酒样中检测到，其相对含量仅为0.07%。酵母发酵与陈酿过程是酯类物质形成的主要途径，大多数酯类具有花香或水果香[29]。

醛酮类物质常具有特殊的香气，同时能使酒体香气趋于融合。糠醛有似杏仁的芳香气味，苯甲醛具有浆果香味[6]。醛类物质主要由高级醇氧化而来或美拉德反应产生。除发酵产生外，也可由氨基酸脱胺脱羰基生成，微量的醛在黄酒香气中起放香作用，黄酒加热杀煎贮存一段时间后，会提高其中乙醛和一些小分子醛类的浓度，而这些醛化合物一般可与醇类、甲硫醇等发生缩合反应，产生与本身不同香气，使黄酒风味更加复杂[15]。目前，关于黄酒烷类化合物成分的报道极少。苏海荣等[5]也检测到一些烷类化合物，推断可能是一些大分子物质发生化学反应产生。烷烃类物质因气味微弱一般可以忽略[30]。上述结果表明，不同年份的挥发性香气物质成分及含量不同，从中可以大概了解黄酒独特香气的物质来源，也可简单地判断出所测酒样的年份，为即墨黄酒酿造过程中的品质控制提供了依据。

醇酯比是指待测样品中的高级醇和总酯的比例，各年份醇酯比见图5。2009年酒样比其它年份醇酯比高，说明其醇香更加浓厚；2015年醇酯比最低，酯类物质含量较高，这可能与酵母的添加量和发酵温度有关，高温发酵会促进酯类物质的形成[31]。

图5 4个年份的醇酯比Fig.5 The proportion of alcohols and esters for four years

韩笑等[32]研究发现黄酒样品随贮存时间的增长，高级醇、酚类风味物质的种类呈现减少的趋势。醇类整体呈现下降的趋势，主要是醇类在陈酿阶段与酸等发生酯化反应生成酯类物质[33]。本试验发现苯乙醇、异戊醇的相对含量均随陈酿时间的增加而减少。胡健等[34]研究表明黄酒中的醛类物质是在陈酿过程中产生，主要由高级醇的氧化或美拉德反应产生[33]。褚小米[33]等发现缩醛类物质因受各种物质浓度及温度的影响而呈无规律的变化。酯类是使酒体变得醇香浓郁的重要原因，在陈酿期间呈先下降而后上升的趋势，这可能是陈酿后期发生醇、酸酯化反应或水解酯交换的原因[35]。

3 结论

即墨黄酒优化后的最佳萃取条件：萃取探针选择CAR/PDMS/DVB复合涂层的红色探针，萃取温度50℃，萃取时间60 min，NaCl添加量0.15 g/mL。在最佳萃取条件下用GC-MS测定2009年、2012年、2013年、2015年4个年份的酒样，结果分别检测到 16，15，15，19种香气物质。苯乙醇、苯乙酸乙酯、苯丙酸乙酯、丁二酸二乙酯在4份酒样中均有检出，它们是构成黄酒芳香主体的来源。苯乙醇作为黄酒国标中特别列出的风味物质，其具有淡雅、甜润、玫瑰气味的芳香。苯乙酸乙酯具有甜水果香气，丁二酸二乙酯呈微弱的果香气，味微甜，带涩、苦。不同年份酒样中所含香气物质的种类和相对含量不同，苯乙醇和丁二酸二乙酯等重要风味物质的相对含量呈逐年减少的趋势，苯乙酸乙酯的相对含量也呈减少趋势。除2015年酒样外，在其它酒样均检测到十六烷酸乙酯，呈微弱蜡香、果爵和奶油香气。十二烷酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯在2015年酒样中相对含量较高。乙酸苯乙酯和壬酸乙酯仅在2015年酒样中检出，前者具有玫瑰花香，后者呈水果样气味，芳香带甜。醛酮类物质并无明显变化趋势。