羽扇豆醇通过MAPKs信号通路对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的抑制作用研究Δ

江兴菊，潘年松，田晓云，黄梅，罗俊#（.贵州医科大学基础医学院，贵阳55005；.遵义医药高等专科学校药学院，贵州遵义 563006）

羽扇豆醇别名蛇麻醇酯，是一种五环三萜类化合物，广泛存在于多种水果（芒果、橄榄等）、蔬菜（卷心菜、青椒、西红柿等）及药用植物（芦荟）中[1]。该化合物具有较强的抗氧化和抗炎作用，可用于病原菌感染、肿瘤及糖尿病等症的治疗[2-5]。近年来研究发现，羽扇豆醇能显著抑制肝癌、直肠癌、结肠癌等肿瘤细胞的生长[6-8]。同时有研究指出，该化合物可明显抑制人乳腺癌MCF-7细胞的增殖，并诱导其凋亡，但作用机制尚未完全阐明[9]。丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）是细胞内广泛表达的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可参与多种细胞反应的调节，如细胞增殖、分化、凋亡等[10]。研究显示，MAPKs在乳腺癌的发生和发展中具有重要作用，可参与介导乳腺癌细胞的增殖与凋亡[11]。然而，羽扇豆醇是否可通过MAPKs信号通路来抑制MCF-7细胞的增殖尚未见相关报道。为此，本研究以人乳腺癌MCF-7细胞为对象，考察羽扇豆醇对细胞增殖的影响，并从调控MAPKs信号通路的角度出发初步探讨其可能机制，以期为羽扇豆醇用于乳腺癌的临床治疗提供实验基础。

1 材料

1.1 仪器

2001HY-6003型CO2细胞培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司）；011007型超净工作台（苏州净化设备有限公司）；ELx800-MV型酶标仪（美国BioTek公司）；MDF-328E型超低温冰箱（日本Sanyo公司）；DYY-7C型蛋白质电泳仪（北京市六一仪器厂）；Universal HoodⅡ型凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；CKX41型倒置显微镜（日本Olympus公司）；VORTEX-5型涡旋混合器（北京贝登医疗设备有限公司）；Centrifuge 5810R型高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）。

1.2 药品与试剂

羽扇豆醇对照品（上海澄绍生物科技有限公司，批号：CS1809DK01，纯度：＞98%）；PD98059、SP600125、SB203580对照品（均为MAPKs信号通路抑制剂；美国Abcam公司，批号分别为ab120234、ab120065、ab120162，纯度均大于99%）；胎牛血清（FBS）、DMEM培养基（美国Hyclone公司，批号分别为DZK0493、AD17218273）；青链霉素混合液、胰蛋白酶、结晶紫染色液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度试剂盒、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）制备试剂盒、RIPA组织/细胞裂解液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（TBST）溶液（北京索莱宝科技有限公司，批号分别为20180212、20180125、20180411、20170815、20170830、20170913、20170425）；MTT[北京博奥拓科技有限公司，批号：298-93-1；临用前用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）稀释，使其最终质量浓度为5 mg/mL]；兔源细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）、磷酸化 ERK1/2（p-ERK1/2）、c-Jun 氨基末端激酶（JNK）、磷酸化JNK（p-JNK）、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）、磷酸化p38 MAPK（p-p38 MAPK）多克隆抗体（美国Cell Signaling Technology公司，批号分别为#4695、#4370、#8690、#4511、#9252、#4668）；兔源甘油醛-3-硫酸脱氢酶（GADPH）多克隆抗体（内参，武汉三鹰生物技术有限公司，批号：10494-1-AP）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：126526）；ECL超敏发光液（美国Millipore公司，批号：WBKLS0100）；二甲基亚砜（DMSO）、乙醇等试剂均为分析纯，水为纯化水。

1.3 细胞

人乳腺癌MCF-7细胞由中国典型培养物保藏中心提供。

2 方法

2.1 药液配制

取羽扇豆醇对照品12 mg，用DMSO-乙醇溶液（1∶1，V/V）1 mL溶解，得质量浓度为12 mg/mL的贮备液，于4℃保存，备用。临用时，以DMEM培养基将上述贮备液稀释至所需质量浓度。

2.2 细胞培养

取人乳腺癌MCF-7细胞适量，用含10%FBS、1%青链霉素混合液的DMEM培养基于37℃、5%CO2细胞培养箱（下同）中进行常规培养。待细胞融合至70%～80%后，以0.25%胰蛋白酶消化传代，取对数生长期的细胞进行后续试验。

2.3 羽扇豆醇对细胞增殖的影响

采用MTT法检测。取对数生长期的人乳腺癌MCF-7细胞按8 000个/孔接种于96孔板上，培养，待细胞贴壁24 h后，将其随机分为对照组和给药组（羽扇豆醇最终质量浓度分别为7.5、15、30、60、90 mg/L，剂量设置参考文献[12]），每组设置6个复孔。吸弃上清液，对照组细胞加入DMEM培养基100 μL，给药组细胞加入含相应药物的DMEM培养基100 μL，继续培养24 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，孵育3～4 h，吸弃上清液，每孔加入DMSO 150 μL，涡旋振荡10 min，使用酶标仪于490 nm波长处检测各孔的光密度（OD490nm）值，计算细胞存活率[细胞存活率（%）＝（试验组细胞平均OD490nm值/对照组细胞平均OD490nm值）×100%]和半数抑制浓度（IC50）。上述试验重复3次。

2.4 羽扇豆醇对细胞形态学特征的影响

取对数期生长的人乳腺癌MCF-7细胞按2×105个/孔接种于6孔板中，培养，待细胞贴壁24 h后，将其随机分为对照组和给药组（羽扇豆醇最终质量浓度为15、30、60 mg/L，剂量设置参考“2.3”项下的IC50值），每组设置3个复孔。吸弃上清液，对照组细胞加入DMEM培养基2 mL，给药组细胞加入含相应药物的DMEM培养基2 mL，继续培养24 h，用PBS清洗3次后，使用倒置显微镜观察各组细胞的形态学特征并拍照。

2.5 羽扇豆醇对细胞克隆形成能力的影响

采用细胞克隆形成试验检测。取对数生长期的人乳腺癌MCF-7细胞按500个/孔接种于6孔板中，培养，待细胞贴壁24 h后，按“2.4”项下方法分组，每组设置3个复孔。吸弃上清液，对照组细胞加入DMEM培养基2 mL，给药组细胞加入含相应药物的DMEM培养基2 mL，继续培养24 h；弃去培养基，用PBS清洗，加入含10%FBS、1%青链霉素混合液的DMEM培养基适量，培养14 d；弃去培养基，用PBS清洗1～2次，将细胞置于4%多聚甲醛溶液中固定15 min，以结晶紫染色20 min，用水冲洗，常温晾干，使用倒置显微镜观察细胞克隆集落形成情况并拍照，同时计算克隆形成率[克隆形成率（%）＝（克隆集落形成数/接种细胞总数）×100%]。上述试验重复3次。

2.6 羽扇豆醇和MAPKs信号通路抑制剂对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响

采用MTT法检测。取对数生长期的人乳腺癌MCF-7细胞按8 000个/孔接种于96孔板中，培养，待细胞贴壁24 h后，将其随机分为对照组和给药组（羽扇豆醇最终质量浓度为60 mg/mL，剂量设置参考“2.3”项下的IC50值；PD98059、SP600125、SB203580最终浓度均为 10 μmol/L，剂量设置参考文献[13]；PD98059、SP600125、SB203580+羽扇豆醇联用组的剂量同单药组），每组设置6个复孔。吸弃上清液，对照组细胞加入DMEM培养基100 μL，各给药组加入含相应药物的DMEM培养基100 μL，继续培养24 h后，按“2.3”项下方法操作并计算细胞存活率。上述试验重复3次。

2.7 羽扇豆醇对MARKs信号通路相关调控蛋白表达的影响

采用Western blotting法检测。取对数生长期的人乳腺癌MCF-7细胞按2×105个/孔接种于6孔板中，培养，待细胞贴壁24 h后，将其随机分为对照组和给药组（羽扇豆醇最终质量浓度为15、30、60 mg/L，剂量设置参考“2.3”项下的 IC50值；PD98059、SP600125、SB203580最终浓度均为10 μmol/L，剂量设置参考文献[13]；PD98059、SP600125、SB203580+羽扇豆醇联用组的剂量同单药组），每组设置3个复孔。吸弃上清液，对照组细胞加入DMEM培养基2 mL，各给药组细胞加入含相应药物的DMEM培养基2 mL，培养24 h。使用RIPA组织/细胞裂解液提取各组细胞蛋白，以BCA法进行蛋白定量。行SDS-PAGE后，将蛋白转移至PVDF膜上，以5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别加入ERK1/2（1∶1 000）、p-ERK1/2（1∶1 000）、JNK（1∶1 000）、p-JNK（1∶1 000）、p-38 MAPK（1∶1 000）、p-p38 MAPK（1∶1 000）、GAPDH（1∶5 000）一抗，4℃孵育过夜，用TBST溶液清洗3次，每次5 min；加入相应二抗（1∶5 000），室温孵育40 min，用TBST溶液清洗3次，每次5 min；以ECL显色后，采用凝胶成像系统成像并使用ImageJ v1.8.0软件分析，以目的蛋白与内参（GADPH）的条带灰度值比值表示目的蛋白的相对表达量。上述试验重复3次。

2.8 统计学方法

采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 羽扇豆醇对人乳腺癌MCF-7细胞增殖影响的检测结果

与对照组比较，15、30、60、90 mg/L羽扇豆醇组细胞的存活率均显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），详见表1。羽扇豆醇的IC50值为52.94 mg/L，故本研究选择15、30、60 mg/L进行后续试验。

表1 羽扇豆醇对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响（±s，n＝3）Tab 1 Effects of lupeol on the proliferation of human breast cancer MCF-7 cells（±s，n＝3）

表1 羽扇豆醇对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响（±s，n＝3）Tab 1 Effects of lupeol on the proliferation of human breast cancer MCF-7 cells（±s，n＝3）

注：与对照组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别对照组7.5 mg/L羽扇豆醇组15 mg/L羽扇豆醇组细胞存活率，%61.98±1.88＊44.96±1.10＊＊36.12±2.70＊＊细胞存活率，%100.90.78±3.95 81.87±3.70＊组别30 mg/L羽扇豆醇组60 mg/L羽扇豆醇组90 mg/L羽扇豆醇组

3.2 羽扇豆醇对人乳腺癌MCF-7细胞形态学特征影响的观察结果

对照组细胞生长情况良好，细胞边缘及胞核清晰。与对照组比较，经不同剂量羽扇豆醇作用24 h后，细胞形态发生改变，其中15 mg/L羽扇豆醇组有少数细胞脱落漂浮，细胞数量开始减少，部分细胞固缩、变圆，体积变小；30、60 mg/L羽扇豆醇组的大部分细胞固缩、变圆，并可见大量的死细胞和细胞碎片，详见图1。

图1 羽扇豆醇对人乳腺癌MCF-7细胞形态学特征影响的显微图（×100）Fig 1 Micrographs of the effects of lupeol on the morphological characteristics of human breast cancer MCF-7 cells（×100）

3.3 羽扇豆醇对人乳腺癌MCF-7细胞克隆形成影响的检测结果

与对照组比较，经15、30、60 mg/L羽扇豆醇作用后，细胞克隆集落形成有随剂量增加而逐渐减少的趋势，各给药组细胞的克隆形成率均显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），详见图2、表2。

图2 羽扇豆醇对人乳腺癌MCF-7细胞克隆形成的影响Fig 2 Effects of lupeol on the clone formation of human breast cancer MCF-7 cells

3.4 羽扇豆醇和MAPKs信号通路抑制剂对人乳腺癌MCF-7细胞增殖影响的检测结果

与对照组比较，60 mg/L羽扇豆醇组细胞的存活率显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.01）；而10 μmol/L PD98059、SP600125、SB203580组细胞的存活率与对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。与60 mg/L羽扇豆醇组比较，各抑制剂与羽扇豆醇联用组细胞的存活率均显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），详见表3。

表2 羽扇豆醇对人乳腺癌MCF-7细胞克隆形成率的影响（±s，n＝3）Tab 2 Effects of lupeol on the clone formation rate of human breast cancer MCF-7 cells（±s，n＝3）

表2 羽扇豆醇对人乳腺癌MCF-7细胞克隆形成率的影响（±s，n＝3）Tab 2 Effects of lupeol on the clone formation rate of human breast cancer MCF-7 cells（±s，n＝3）

注：与对照组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别对照组15 mg/L羽扇豆醇组克隆形成率，%15.25±2.50＊＊3.61±2.42＊＊克隆形成率，%56.32±3.51 32.24±1.23＊组别30 mg/L羽扇豆醇组60 mg/L羽扇豆醇组

表3 羽扇豆醇和MAPKs信号通路抑制剂对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响（±s，n＝3）Tab 3 Effects of lupeol and MAPKs signaling pathway inhibitors on the proliferation of human breast cancer MCF-7 cells（±s，n＝3）

表3 羽扇豆醇和MAPKs信号通路抑制剂对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响（±s，n＝3）Tab 3 Effects of lupeol and MAPKs signaling pathway inhibitors on the proliferation of human breast cancer MCF-7 cells（±s，n＝3）

注：与对照组比较，＊＊P＜0.01；与60 mg/L羽扇豆醇组比较，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.control group，＊＊P＜0.01；vs.60 mg/L lupeol group，#P＜0.05，##P＜0.01

细胞存活率，%100.48.6±2.05＊＊108.11±1.30 66.31±3.61#92.23±2.89 75.75±1.37##92.72±2.31 64.08±0.63#组别对照组60 mg/L羽扇豆醇组10 μmol/L PD98059组10 μmol/L PD98059+60 mg/L羽扇豆醇组10 μmol/L SP600125组10 μmol/L SP600125+60 mg/L羽扇豆醇组10 μmol/L SB203580组10 μmol/L SB203580+60 mg/L羽扇豆醇组

3.5 羽扇豆醇对MARKs信号通路相关调控蛋白表达影响的检测结果

与对照组比较，羽扇豆醇各剂量组细胞p-ERK1/2以及30、60 mg/L羽扇豆醇组细胞p-JNK、p-p38 MAPK的相对表达量均显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；而羽扇豆醇各剂量组细胞ERK1/2、JNK、p38 MAPK的相对表达量，15 mg/L羽扇豆醇组p-JNK、p-p38 MAPK的相对表达量以及10 μmol/L PD98059、SP600125、SB203580组细胞ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、p38 MAPK、p-p38 MAPK的相对表达量与对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。与60 mg/L羽扇豆醇组比较，各抑制剂与羽扇豆醇联用组细胞p-ERK1/2、p-JNK、p-p38 MAPK的相对表达量均显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；而各联用组细胞ERK1/2、JNK、p38 MAPK的相对表达量与60 mg/L羽扇豆醇组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。详见图 3、表4（表中，“-”表示该抑制剂并非为某蛋白对应的抑制剂，故无需检测，无相应结果）。

4 讨论

近年来乳腺癌的发病率不断上升，是女性癌症患者死亡的首要原因，但其发病机制尚未完全阐明[14]。目前，乳腺癌临床治疗以手术、化疗、放疗及综合治疗等为主，但患者预后不佳，且化疗药物副作用极大，严重影响了患者的治疗效果[15]。因此，寻找毒性较低的治疗药物成为乳腺癌临床研究的热点之一。已有研究证实，羽扇豆醇因其较低的毒性和广泛的药理作用引起了学者的普遍关注，是一种极具开发价值的抗肿瘤化合物[8]。有研究表明，羽扇豆醇可抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖并诱导其凋亡，其可能机制为该化合物可抑制细胞能量代谢途径中生成琥珀酰辅酶A以及底物磷酸化生成腺苷三磷酸的反应，从而抑制细胞的增殖[16]。有文献指出，MAPKs信号通路在乳腺癌的发生和发展中发挥着重要的调节作用[11，17]。但羽扇豆醇对MCF-7细胞增殖的抑制作用是否与MAPKs信号通路有关尚未见报道。为此，本研究初步考察了羽扇豆醇对MCF-7细胞增殖的抑制作用以及该作用与MAPKs信号通路的相关性。

本研究结果显示，15、30、60、90 mg/L羽扇豆醇均可显著降低细胞的存活率，提示羽扇豆醇可抑制MCF-7细胞的增殖，与文献报道的结果[9，16]基本一致。此外，本研究测得该化合物的IC50值为52.94 mg/L，故本研究选择15、30、60 mg/L进行后续试验。形态学观察结果显示，经15、30、60 mg/L羽扇豆醇处理后，MCF-7细胞形态发生了不同程度的改变，且随着羽扇豆醇剂量的增加，细胞的数量有逐渐减少的趋势，且可见细胞固缩、变圆、体积变小、死细胞和细胞碎片产生等现象。细胞克隆形成试验结果显示，15、30、60 mg/L羽扇豆醇均可显著降低细胞的克隆形成率，且细胞克隆集落形成有随剂量增加而逐渐减少的趋势，进一步证实了羽扇豆醇对MCF-7细胞增殖的抑制作用。

图3 羽扇豆醇对人乳腺癌MCF-7细胞MAPKs信号通路相关调控蛋白表达影响的电泳图Fig 3 Electrophoregrams of lupeol on MAPKs signaling pathway-related regulatory proteins of human breast cancer MCF-7 cells

表4 羽扇豆醇对人乳腺癌MCF-7细胞MAPKs信号通路相关调控蛋白相对表达量的影响（±s，n＝3）Tab 4 Effects of lupeol on relative expression of MAPKs signaling pathway-related regulatory proteins of human breast cancer MCF-7 cells（±s，n＝3）

表4 羽扇豆醇对人乳腺癌MCF-7细胞MAPKs信号通路相关调控蛋白相对表达量的影响（±s，n＝3）Tab 4 Effects of lupeol on relative expression of MAPKs signaling pathway-related regulatory proteins of human breast cancer MCF-7 cells（±s，n＝3）

注：与对照组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与60 mg/L羽扇豆醇组比较，#P＜0.05Note：vs.control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.60 mg/L lupeol group，#P＜0.05

组别对照组15 mg/L羽扇豆醇组30 mg/L羽扇豆醇组60 mg/L羽扇豆醇组10 μmol/L PD98059组10 μmol/L PD98059+60 mg/L羽扇豆醇组10 μmol/L SP600125组10 μmol/L SP600125+60 mg/L羽扇豆醇组10 μmol/L SB203580组10 μmol/L SB203580+60 mg/L羽扇豆醇组ERK1/2 0.93±0.05 0.88±0.06 0.90±0.02 0.87±0.05 0.94±0.03 0.84±0.02 p-ERK1/2 0.27±0.04 0.56±0.04＊0.73±0.03＊0.80±0.02＊＊0.34±0.06 0.60±0.04#JNK 0.86±0.06 0.85±0.04 0.88±0.06 0.86±0.04 p-JNK 0.29±0.04 0.33±0.08 0.50±0.03＊0.58±0.02＊＊p-38 MAPK 0.69±0.12 0.67±0.04 0.58±0.06 0.68±0.04 p-p38 MAPK 0.39±0.05 0.48±0.04 0.68±0.05＊0.82±0.02＊＊----0.87±0.02 0.89±0.02 0.26±0.02 0.37±0.03#--------0.37±0.06 0.58±0.02#------------0.66±0.03 0.69±0.10

MAPKs家族主要有3个亚族，即ERK1/2、JNK和p38 MAPK，三者均可通过多个底物（如磷酸化转录因子、与细胞骨架相关的细胞和酶等）来调控细胞的多种生理过程（如细胞凋亡、癌基因转化和细胞增殖、分化等）[10，18-19]。为探讨MAPKs信号通路是否参与了羽扇豆醇对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的抑制过程，本研究选用ERK1/2抑制剂（PD98059）、JNK抑制剂（SP600125）和p38 MAPK抑制剂（SB203580）作为参照。MTT试验结果显示，60 mg/L羽扇豆醇组细胞的存活率较对照组显著降低，而各抑制剂与羽扇豆醇联用组细胞的存活率均较羽扇豆醇单用组显著增加，表明加用ERK1/2、JNK、p38 MAPK抑制剂可逆转羽扇豆醇对MCF-7细胞增殖的抑制作用。这提示羽扇豆醇对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的抑制作用可能与MAPKs信号通路有关。

有研究证实，MAPKs信号通路相关调控蛋白的磷酸化水平对多种肿瘤细胞的增殖、凋亡等均具有重要的调控作用[20-21]。Western blotting试验结果显示，羽扇豆醇各剂量组细胞p-ERK1/2以及30、60 mg/L羽扇豆醇组细胞p-JNK、p-p38 MAPK的相对表达量均较对照组显著升高，各抑制剂与羽扇豆醇联用组细胞p-ERK1/2、p-JNK、p-p38 MAPK的相对表达量均较60 mg/L羽扇豆醇组显著降低，表明加用ERK1/2、JNK、p38 MAPK抑制剂可抑制羽扇豆醇对MAPKs信号通路相关调控蛋白的促磷酸化作用。这提示羽扇豆醇对MCF-7细胞增殖的抑制作用可能与诱导ERK1/2、JNK、p38 MAPK磷酸化有关，这与Cao J等[13]的研究结果基本一致。

综上所述，羽扇豆醇对人乳腺癌MCF-7细胞的增殖具有明显的抑制作用，其机制可能与促进MAPKs信号通路相关调控蛋白的磷酸化有关，但其具体作用靶点和机制有待后续研究进一步确证。