Nanofat制作、临床应用及作用机制的研究进展

曾茂娇 （综述），贺光照（审校）

（重庆医科大学附属第一医院整形烧伤科，重庆，400016）

自Coleman等学者对脂肪移植技术进行标准化以来，颗粒脂肪移植已成为整形外科中非常重要的材料，广泛应用于全身各部位软组织缺失的修复、皮肤老化的改善及慢性创面的治疗等，疗效肯定[1]。颗粒脂肪分为大颗粒脂肪（macrofat）和小颗粒脂肪（microfat）[2]。Macrofat多用于改善因先天性、外伤、疾病或老化引起的局部软组织缺损，一般采用直径2mm的钝针进行注射，适用于乳房和臀部等大范围部位的填充[3]。随着面部自体脂肪填充的发展，临床上逐渐开始使用0.7mm直径的注脂针来注射更细的颗粒脂肪，这种直径的脂肪组织被称为Microfat[2]。颗粒脂肪移植在容积改善方面作用较大，然而，对于面部细小沟槽、皱纹、眼睑、口周、颈纹、瘢痕组织等精细区域的填充，颗粒脂肪难以顺利通过细小注射针，必须使用更微小的脂肪组织进行注射[4]。

Tonnard等于2013年报道通过机械乳化的过程生产脂质乳液，称之为“nanofat”[5]，直译为“纳米脂肪”。应当注意，nanofat并非等同于纳米技术，Friji认为nanofat一词有待商榷，因为细胞的大小是微米级别，乳化过滤后的脂肪难以达到纳米级别，并建议将nanofat改为supermicrofat[6]，但目前nanofat一词仍被广泛使用，已成为约定俗成的名称。大量研究表明nanofat中含有丰富的脂肪组织来源的SVF细胞与ADSCs，可以通过旁分泌作用或直接分化成脂肪细胞来提高脂肪移植物的存活率，对组织修复和再生具有重要作用，一经报道就被应用于改善皮肤老化状态、抑制瘢痕增生及促进创面愈合等治疗过程，收到了满意的临床效果[5，7，8]。现对nanofat的制作方法、临床应用进展及其作用机制做一综述。

1 Nanofat的制作方法

1.1 经典Tonnard法[5]

该法由Tonnard提出，具体操作步骤为：使用标准的脂肪抽吸装置进行负压吸脂术，吸脂部位选取为下腹部，吸脂管选择为具有多口的直径为3mm的套管，该套管具有直径为1mm的尖锐侧孔。获取的脂肪以生理盐水漂洗，并通过具有0.5mm孔径的无菌尼龙布过滤，过滤后脂肪组织留取进行机械乳化。脂肪的乳化是通过使用Luer-Lok连接器连接两个10mL注射器，借助注射器的对推使脂肪在注射器间来回转移实现的。经过30次转移后，脂肪变成乳液，并呈现出乳白色的外观。乳化结束后再次用无菌尼龙布过滤脂肪液以去除可能阻塞细针的结缔组织，将流出物收集在无菌接收器中，该流出物即为“nanofat”。

1.2 各种改良技术

在Tonnard法基础上，不同学者对其进行了相应的改良。Liang等[9]和Wei等[10]通过使用20mL的注射器来实现脂肪的乳化，Wei等通过3min的对推过程获取乳糜脂肪组织[10]，李聪等则进行90次的对推过程获取乳糜脂肪组织[11]。Gu 等[12]和Kemaloglu[13]在得到乳糜化脂肪后用离心机以3000 r/min的速度离心3 min，取中层组织进行相关研究，并称之为“浓缩nanofat”。Bi等对Tonnard法进行了更大的改进，采用0.2 mg/ml胶原酶I消化新鲜脂肪组织15min后再以330×g离心7min，收集上清液脂肪细胞部分并通过细胞滤网过滤，收集流出物称之为“Vivo nanofat”，其研究显示Vivo nanofat体内移植后的吸收率明显低于nanofat[14]。Lo Furno等在得到乳糜化的脂肪后，未将脂肪乳液再次挤压通过纱布过滤，将此乳糜化的脂肪定义为“nanofat 2.0”，并发现nanofat 2.0中ADSCs的密度高于普通的nanofat[15]。Jan 等也通过类似的方式获取nanofat，称之为“未过滤的nanofat”[16]。

2 Nanofat的临床应用

2.1 面颈部年轻化

通过使用新分离的nanofat进行移植，或与自体颗粒脂肪相结合的共同移植是改善皮肤老化状态和恢复皮肤活力的有效途径，尤其适用于面部细小沟槽、黑眼圈、皱纹及颈纹等面颈部精细部位的局部注射治疗。李聪等应用nanofat于48例患者眶周凹陷、细纹及暗沉处进行真皮及皮下层内注射，绝大多数患者于1次注射填充后即达到明显改善，满意度高[11]。Tonnard等将nanofat移植用于口周皱纹（38例），眉间凹陷皮肤（15例），晒伤皮肤（8例），疤痕（4例）和黑眼圈（2例）的治疗，取得良好的临床结果，患者皮肤质量有显着改善，未观察到如感染、脂肪囊肿等严重的并发症[5]。Liang等研究发现103名接受nanofat和富血小板纤维蛋白（PRF）联合注射的患者较128名注射透明质酸的患者，面部皮肤纹理得到更大程度的改善，满意度更高[9]。Wei等采用nanofat、PRF和自体颗粒脂肪共同移植治疗62名软组织缺陷或皮肤衰老的患者，其临床疗效大于单纯的脂肪移植组，总体满意率高于90%[10]。Bi等为一名颈纹突出的患者进行局部注射nanofat，随访6个月，该患者颈纹得到显著改善[14]。

2.2 瘢痕的治疗

近来研究发现通过局部注射nanofat治疗各类型的瘢痕可收到满意的临床效果。焦虎等将nanofat注射至33例凹陷性瘢痕组织内， 3月后可见瘢痕凹陷明显变浅，颜色变淡、弹性更好、质地更柔软[17]。Gu等使用“浓缩nanofat”结合小颗粒脂肪联合移植治疗25例萎缩性面部疤痕，患者术后在疤痕颜色、硬度、色素沉着、厚度等方面均有明显改善，术后还观察到基底细胞层中黑色素染色的增强以及发现新生的皮脂腺和汗腺[12]。Bhooshan等将nanofat注射到34例不同病因的瘢痕组织中，术后3个月可明显缓解疼痛、瘙痒、僵硬度、厚度、颜色、不规则度等症状表现，还可改善血管分布、缓解程度、柔韧性、厚度和色素沉着等瘢痕特征[18]。Jan等将“未过滤的nanofat”注射到48例烧伤后面部瘢痕的皮下或皮内层面，随访6个月，发现瘢痕组织在色素沉着和柔韧性两方面均具有显著性的改善[16]。

2.3 其他治疗

Nanofat可促进创面愈合和皮片成活：在1例左前壁具有创伤性皮肤缺损的病例中，Kemaloglu先对创面进行自体中厚皮片移植，随后将nanofat注射入移植皮片下方，随访6个月，皮肤移植物存活良好且具有优异的柔韧性，创面的血管分布也令人满意[13]。有学者将nanofat用于治疗外阴硬化性苔藓，2次注射后患者外阴形态明显改善，皮肤黏膜质地及弹性明显好转，瘙痒、灼烧感消失，性生活质量明显提高[19]。通过关节内注射Nanofat还可用于颞下颌关节病的治疗，能有效的改善患者的疼痛、开口度、关节弹响等表现[20]。此外，相较于颗粒脂肪，nanofat移植更易注射于需要高精度注射的头皮区域，该技术可用作毛囊移植的补充物或作为脱发的再生治疗[21]。

3 Nanofat作用机制的探讨

3.1 Nanofat含有大量SVF及ADSCs

Nanofat是一种源自脂肪组织的天然乳化悬浮液，研究显示乳化过程使成熟的脂肪细胞完全被破坏，但未对干细胞的产量、活力、或成脂分化能力等产生显著性的影响[8]。因此nanofat内虽不含有成熟脂肪细胞，但却富含大量SVF，SVF中含有不同类型的细胞，如内皮细胞，单核细胞，粒细胞和巨噬细胞，还包括大量间充质干细胞（MSCs）[5，22]。Tonnard 等 报 道 nanofat 中 SVF 的 数 量 为1.98×106个/ 100mL nanofat，SVF中CD34细胞数量为0.1×106个/100mL nanofat[5]，具有CD34表型的细胞代表着具有巨大干细胞增殖能力的细胞群，在体外这类细胞具有多向分化潜能。Nanofat中ADSCs所占比例约为3.11%±0.8%，为标准脂肪抽吸物中的3倍[7]。ADSCs不仅具有多项分化功能，还具有旁分泌能力，可分泌血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)等，进而调节新血管形成及组织再生，这些因子还具有抗氧化作用，可以抵抗在任何状态下自由基形成的皮肤损伤[9，23]。此外，ADSCs能在真表皮细胞的影响下通过表型转换分化为成纤维细胞及角质形成细胞直接参与真表皮的组织结构再生[24]。

3.2 Nanofat能促进脂肪移植物的存活

MSCs已被证明可提高脂肪移植物的活力，这主要是通过促进血管生成来实现的[7，22，24]。Yu 等将nanofat与颗粒脂肪移植物共同移植入裸鼠皮下，术后12周结果显示，与对照组相比，共移植组表现出更高的移植物重量和体积保留，更好的组织结构和更高的毛细血管密度，这表明nanofat可以促进新生血管形成并改善脂肪移植物的存活[7]。另一方面，nanofat中含有大量的死亡的脂肪细胞，已知凋亡细胞释放细胞因子并吸引诱导生长因子的巨噬细胞[25]，因此，共同注射乳化分解的脂肪细胞可能对ADSCs的分化和组织再生具有刺激作用。

3.3 Nanofat含有多种抗纤维化因子

Nanofat较颗粒脂肪组织富有更高浓度的ADSCs，ADSCs可以合成分泌多种抗纤维化因子，如白细胞介素-10（IL-10）、HGF等[26]。这些物质可参与皮肤黏膜创面的修复过程，抑制瘢痕生长的同时可改善皮肤质地，在面部年轻化、创伤修复中起到很好的治疗效果[27，28]。在伤口愈合的增生期，ADSCs分泌的VEGF-A和bFGF可强而有效地促进血管内皮细胞迁移、增殖及分化，从而利于血管生成及稳定[29]。此外，脂肪细胞外基质中还含有抵抗素及肿瘤坏死因子（TNF）等物质，可诱导成纤维细胞的的凋亡，抑制其过度分泌致纤维物质；同时还能降低肥大细胞活性，使瘢痕增生得到一定程度的抑制[30]。近来研究还发现ADSCs能够通过旁分泌作用抑制增生性瘢痕来源的成纤维细胞（HSF）内I、III型胶原，转化生长因子-β1（TGF-β1），白细胞介素-6（IL-6），α-肌动蛋白（α-SMA），纤连蛋白（Fibronectin）及结缔组织生长因子（CTGF）等促瘢痕增殖基因的表达，同时促进核心蛋白聚糖（Decorin）和基质金属蛋白酶-1（MMP-1）等抗纤维化的基因的表达[31]。上述多种因素共同作用可有效改善皮肤质地，抑制瘢痕的增生。

3.4 其他抗纤维机制

Nanofat中的ADSCs除可通过分泌抗纤维化因子抑制瘢痕增生外，还可能存在其他抗纤维化的机制。研究表明，创面的炎症环境可激发MSCs启动免疫调节作用，上调前列腺素E2（PGE2）及环氧化酶-2（COX-2）的表达，以减轻炎症反应并抑制炎症反应延长导致的免疫功能紊乱[32]。ADSCs 还可促进T细胞产生诱导性NO，后者可改变ROS/RNS（反应活性氮类物质）平衡，阻止纤维化形成[33，34]。除此之外，ADSCs还能抑制HSF中TGF-β1及其细胞内信号通路相关分子（如p-smad2，p-smad3，p-Stat3和p-ERK）的蛋白质表达水平，从而实现抑制HSF的增殖、迁移和收缩等性能[31，35，36]。

4 临床展望

由于缺乏完整的脂肪细胞，nanofat的体积效应显然非常有限，与颗粒脂肪移植相比，nanofat移植的适应症是截然不同的。Nanofat的发明实际上提供了一种简单制备SVF及ADSCs的技术，更扩大了脂肪移植的治疗范围，为改善颗粒脂肪移植的存活率、瘢痕的治疗及机体精细部位的局部注射提供了新思路，为整形和重建手术中的脂肪移植物的选择及补充提供了一种潜在的临床可行方法。