三种互花米草天然化合物降尿酸作用研究

张焕仕，张鹤云，宰学明，赵 飞，雷 鹏，刘 畅，朱昌玲，钦佩*

(1. 南京野生植物综合利用研究院，江苏 南京 211111；2. 南京大学盐生植物实验室，江苏 南京 210093；3. 金陵科技学院园艺园林学院，江苏 南京 210038)

互花米草(SpartinaalternifloraLoisel.)是禾本科米草属多年生草本植物，原产于北美大西洋沿岸，多在中潮带上部至高潮带生长发育。1979年南京大学仲崇信教授等将互花米草由美国引入我国，目前在我国沿海地区分布总面积达到55 468 hm2[1]。研究表明，互花米草富含黄酮、多糖、皂苷等多种生物活性成分[2-4]。通过GC-MS分析显示，米草多糖的单糖主要为鼠李糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖[3]。韩顺风等研究确定了互花米草中含有的对羟基肉桂醛、麦角甾醇、麦黄酮等15个化合物的结构[4]。

近年来随着经济发展和生活水平提高，高尿酸血症发病率越来越高。高尿酸血症除了会引发痛风以外，还与高血压、动脉粥样硬化、慢性肾脏疾病以及其它代谢紊乱症的发生具有内在联系[5,6]。目前常用高尿酸血症临床治疗药物(如别嘌呤醇)均存在较大毒副作用，对胃肠道、肝脏、肾脏等存在一定程度损伤，引起人们对传统类高尿酸血症治疗药物安全性的关注[7]。因此，从植物资源中寻找安全、有效的降血尿酸药物已成为一个研究热点[8-10]。为探索互花米草降尿酸的生物功效，我们对互花米草进行了活性物质提取、分离、纯化和鉴定，获得多个单体化合物(另文发表)。其中，异戊基奎尼酸、对香豆酸和苜蓿素都是典型的抗菌消炎、保肝利胆、降血脂、抗氧化、抗痛风等的功能成分。本试验选择互花米草提取物中分离纯化的异戊基奎尼酸、苜蓿素和对香豆酸进行降尿酸动物模型试验，选择苯溴马隆为阳性对照，选择两种形态的米草提取物作为拟阳性对照，考察米草天然化合物降低小鼠血尿酸的效应，为互花米草的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

昆明种小白鼠，雄性，80只，体重20-25 g，由南京医科大学动物饲养中心提供，清洁级：二级，动物合格证号：SCXK(苏) 2016 - 0003。造模剂次黄嘌呤由Aladdin Chemistry公司生产(批号：31813)；阳性对照：苯溴马隆(德国赫曼大药厂，批号：180619)；拟阳性对照：互花米草精粉、去糖互花米草精粉；空白对照处理：生理盐水；试验处理：米草提取物中分离鉴定的三个化合物：绿原酸(异戊基奎尼酸)、苜蓿素、对香豆酸；羧甲基纤维素钠(CMC-Na)由世贸天珍制药有限公司生产。注射器：1 ml、5 ml；离心管：1.5 ml、2 ml、5 ml；采血用毛细血管；饲喂器：平头9#针头；贝克曼LX20全自动生化分析仪。

1.2 试验方法

1.2.1 试剂配制

(1)互花米草精粉配制

采集互花米草地上部分100 kg，晒干、切割成2～3 cm长，加20倍热水浸提，浓缩提取液为深棕色液体(10 kg左右)，喷雾干燥制得互花米草精粉。准确称取米草精粉1 g，用0.8 % CMC-Na溶液将米草精粉(按总皂苷含量5.7 %计)配制成4.5 mg/ml剂量试液。

(2)去糖互花米草精粉配制

称取米草精粉2 g，用20 ml 70%乙醇沉淀并过滤去除米草精粉的多糖，浓缩制成去糖米草精粉浸膏，再用0.8 % CMC-Na溶液将去糖米草精粉浸膏(按总皂苷含量5.7 %计)配制成4.5 mg/ml的剂量试液。

(3)试验药剂配制

分别称取20 mg绿原酸、20 mg苜蓿素、20 mg对香豆酸，各自溶于40 ml 0.8 % CMC-Na溶液中，使三种化合物的CMC-Na溶液浓度均为0.5 mg/ml。

1.2.2 模型动物试验组别设计

空白对照组(生理盐水)10只小鼠；模型组(CMC-Na)10只小鼠；米草精粉组(4.5 mg/ml)10只小鼠；去糖米草精粉组(4.5 mg/ml)10只小鼠；绿原酸组 (0.5 mg/ml)10只小鼠；苜蓿素组 (0.5 mg/ml)10只小鼠；对香豆酸组(0.5 mg/ml)10只小鼠；苯溴马隆组(0.5 mg/ml)10只小鼠。

1.2.3 处理方法

对各组受试动物每天给药一次(每天给药前称体重)，连续给药7天，各动物组实验方法： 1、3、4、5、6、7组动物分别进行胃内给药，模型组胃内给CMC-Na；具体情况如下：(1)空白对照组(生理盐水)0.1 ml/10g；(2)模型组(CMC-Na)0.1 ml/10g；(3)米草精粉组0.1 ml/10g；(4)去糖米草精粉组0.1 ml/10g；(5)绿原酸组0.1 ml/10g；(6)苜蓿素组0.1 ml/10g；(7)对香豆酸组0.1 ml/10g；(8)苯溴马隆组0.1 ml/10g。

第8天最后一次给药30 min后，除生理盐水组，其他各组腹腔注射已配制的50 mg/ml次黄嘌呤，按剂量1000 mg/kg体重给药。在给药后30-40 min，立刻摘除眼球采血置离心管中，在室温下待血清渗出，取出离心(15000 rpm，4 min)。吸取上层血清置带盖的样品管中，根据所得血清体积，全部用生理盐水配制到所需体积。在贝克曼LX20全自动生化分析仪上测定血尿酸(uric acid，UA)、血糖(blood glucose，GLU)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，Cr)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、总蛋白(total protein，TP)、谷丙转氨酶(glutamic-pyr uvic transaminase，GPT)等指标。

1.3 数据分析

所有数据经SPSS19.0软件包处理，采用单因素方差分析，用均数±标准差(x±s)表示。

2 结果与讨论

2.1 各组血清UA、Cr、BUN和GPT的变化

由表1可知，小鼠经由连续7 d的胃内给药后，模型组血清UA显著升高为空白组的5.45倍；苯溴马隆是我国临床上常用的抑制尿酸治疗痛风的药物[11]，本试验中高尿酸小鼠模型经过胃内给苯溴马隆后降低了血清中UA水平，由此表明高尿酸小鼠模型和治疗组模型建立成功。试验结果表明，三种米草化合物和两个米草精粉组都不同程度的降低了高尿酸血症小鼠血清UA水平，且对香豆酸组降尿酸效果显著(P< 0.05)。由此可见，在本试验条件下米草对香豆酸组与阳性药苯溴马隆组相比具有较好的降尿酸优势。

表1 各组小鼠血清UA、Cr、BUN和GPT的变化

注：*P<0.05表示差异显著，**P<0.01表示差异非常显著，***P<0.001表示差异极显著；1本试验中的绿原酸是异戊基奎尼酸，下同。

血清Cr、BUN水平能较为准确的反应肾实质受损的情况，是肾功能的核心指标[12]。在本试验设计范围内，三个米草化合物组显著降低血清Cr、BUN水平(P<0.05)，阳性对照苯溴马隆组效果是显著(P<0.05)和非常显著(P<0.01)，两个米草精粉组效果则为非常显著(P<0.01)和极显著(P<0.001)(表1)。这说明上述三个米草化合物在肾功能影响方面安全性较好，不仅没有对肾功能造成不良影响，还有一定的保肾作用。同时，米草精粉组可能因同时含有多种生物活性成分而表现出更强的降低血清Cr和BUN水平作用。

血清GPT水平测定结果表明，各试验处理都不同程度降低了高尿酸血症小鼠血清GPT水平，但三种米草化合物和苯溴马隆组的GPT水平与模型组之间的差异没有统计学意义(P>0.05)，两个米草精粉组的差异显著(P<0.05)，其谷丙转氨酶非常接近生理盐水组的正常水平。由此可推测，三种米草化合物没有对肝功能造成显著影响，且米草精粉组有一定的护肝作用。

2.2 各组血清GLU、TC、TG和TP的变化

测定各组小鼠血清GLU、TC、TG和TP的变化结果表明(表2)，与CMC模型组相比，对香豆酸组可非常显著的降低血清GLU和TC水平(P<0.01)，包括阳性对照组和苯溴马隆组的其它试验样品的抑制GLU效果不显著(P>0.05)，但显著的降低了TC水平(P<0.05)。各试验组都能显著降低血清TG水平，其中苜蓿素组和米草精粉组效果具有极显著降低效应(P<0.001)，优于苯溴马隆组的降TG效果(P<0.01)。

比较空白对照组和CMC模型组发现，腹腔注射次黄嘌呤会导致高尿酸血症小鼠血清TP水平显著下降。而与CMC模型组相比，各试验组和苯溴马隆组效果都非常显著的提高了TP水平(P<0.01)，尤以三个米草化合物组和去糖米草精粉组血清TP浓度非常接近生理盐水组的正常水平(表2)。

表2 各组小鼠血清GLU、TC、TG和TP的变化

2.3 米草化合物对体重的影响

测定结果表明(表3)，试验各组(包括生理盐水组、CMC组和苯溴马隆组)喂养7天后体重均有增加，而且在本试验设计范围内，各组动物增重的水平差异不显著(P>0.05)。

表3 各组小鼠体重变化(g)

3 结论

在本试验设计范围内，互花米草中分离纯化出的对香豆酸可显著降低由次黄嘌呤诱导的高尿酸血症小鼠的血清尿酸和血糖水平，优于临床上常用的苯溴马隆的降尿酸和血糖效果。对香豆酸、绿原酸和苜蓿素还能降低高尿酸血症小鼠的血清肌酐、尿素氮、总胆固醇和甘油三酯等，同时还可以显著提高血清总蛋白浓度，具有一定的保护肾、降血脂作用。研究结果也表明，互花米草精粉可能因同时含有多种生物活性成分而具有更强的保肾护肝作用。本研究不仅初步揭示了互花米草发挥降尿酸药效的物质基础，同时也为进一步深入开发降尿酸药物提供了依据和参考。