葫芦素B靶向抑制STAT3抗吉非替尼耐药非小细胞肺癌的研究

丘韶校 曾超朋 何臣 李元广 宋卫东

[摘要] 目的 探讨葫芦素B通过抑制STAT3信号活化，从而拮抗EGFR T790M突变介导的NSCLC吉非替尼耐药的机制。 方法 利用不同浓度的葫芦素B作用于PC-9/GR细胞的不同时期，用CCK-8法测定细胞的增殖抑制、PI染色法检测细胞的周期、Annexin-v/7-AAD双标记法检测细胞的凋亡，检测不同浓度以及作用时间的葫芦素B对PC-9/GR细胞增殖抑制、细胞周期阻滞及细胞凋亡诱导效应。 结果 葫芦素B能够显著抑制PC-9/GR细胞增殖以及对细胞周期的G2/M期有明显阻滞作用，而且呈浓度依赖，随着浓度增加，其增殖抑制作用和阻滞活性也增高，同时观察到PC-9/GR细胞分别加入10 nmol/L、100 nmol/L、1000 nmol/L三种浓度的葫芦素B作用后，抑制了p-Jak2、p-STAT3的表达，且这种抑制呈浓度依赖性，但不影响p-EGFR的激活以及总EGFR、Jak2、STAT3的表达。 结论 葫芦素B能够抑制吉非替尼耐药NSCLC中异常激活的STAT3信号途径，这种抑制具有选择性，从而诱导吉非替尼耐药NSCLC的凋亡。

[关键词] 非小细胞肺癌;吉非替尼;耐药性;葫芦素B

[中图分类号] R734.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）16-0034-04

[Abstract] Objective To investigate the mechanism of cucurbitacin B inhibiting STAT3 signaling to antagonize EGFR T790M mutation-mediated gefitinib resistance to NSCLC. Methods Different concentrations of cucurbitacin B were applied to different periods of PC-9/GR cells. Cell proliferation inhibition was measured by CCK-8 method， cell cycle was detected by PI staining， and cell apoptosis was detected by Annexin-v/7-AAD double labeling method. The effects of cucurbitacin B on the proliferation inhibition， cell cycle blockage and cell apoptosis induction of PC-9/GR cells were detected at different concentrations and effecting times. Results Cucurbitacin B could significantly inhibit the proliferation of PC-9/GR cells and significantly blocked the G2/M phase of the cell cycle， and was concentration dependent. As the concentration increased， its effects of proliferation inhibition and blockage also increased. At the same time， PC-9/GR cells were observed to inhibit the expression of p-Jak2 and p-STAT3 by adding cucurbitacin B at 10 nmol/L， 100 nmol/L and 1000 nmol/L， respectively. Moreover， this inhibition was concentration-dependent， but did not affect the activation of p-EGFR and the expression of total EGFR， Jak2， and STAT3. Conclusion Cucurbitacin B can inhibit the abnormally activated STAT3 signaling pathway in gefitinib-resistant NSCLC. This inhibition is selective， thereby inducing the apoptosis of gefitinib-resistant NSCLC.

[Key words] Non-small cell lung cancer; Gefitinib; Drug resistance; Cucurbitacin B

肺癌的早期診断困难，70%的肺癌患者发现时已属中晚期，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占其中绝大多数，比例达80%以上，但由于NSCLC对放化疗不敏感，NSCLC的治疗仍然是目前临床面临的难题，虽然有手术、化放疗及中成药等综合治疗，NSCLC的治疗仍存在许多问题，5年生存率仍少于10%[1]。目前，靶向药物已被广泛应用于各种肿瘤患者的治疗，疗效显著，吉非替尼作为NSCLC的靶向药物，目前应用广泛，是针对表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂（TKI）的靶向药物，主要用于治疗晚期NSCLC患者，对带有EGFR 激活突变的NSCLC患者有显著的治疗效果，且副作用少，相对于传统化放疗具有明显的优势[2]。但目前国内外研究发现，绝大多数初期对吉非替尼治疗有效的NSCLC患者，在经过10个月左右的缓解期后，出现病灶进展，出现获得性耐药[3]，因此，明确吉非替尼耐药性产生的机制以及研究新方法对抗吉非替尼耐药已经成为NSCLC治疗领域中的热门。

关于NSCLC治疗中吉非替尼如何产生获得性耐药，其分子机制目前仍存在争议，尚未完全明确，目前普遍的观点认为，是由于基因的二次突变和原癌基因的扩增引起，其分子机制是EGFR基因外显子20的T790M二次突变（约50%）和原癌基因c-MET的扩增，导致正常情况下EGFR酪氨酸激酶结合区ATP结合外，还阻止吉非替尼和酪氨酸激酶的进一步结合，导致EGFR蛋白激酶的持续激活，重新激活先前阻断的磷酸化信号途径，并促进肿瘤细胞的持续生长，从而产生耐药[4-7]。但是，不管是基因二次突变，还是原癌基因扩增介导的获得性耐药，维持肿瘤的存活均需要EGFR及其下游MAPK/ERK或PI3K/AKT信号分子的持续活化，因此，近年来国内外许多学者针对以上耐药机制进行了有益的治疗探索。本研究旨在阐明利用葫芦素B的信号分子导向作用，葫芦素B能够选择性抑制吉非替尼耐药NSCLC中持续活化的转录信号转导子与激活子3（STAT3）信号途径，从而诱导吉非替尼耐药NSCLC细胞的凋亡，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 试剂

RPMI1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶（美国Gibco公司），葫芦素B（美国Sigma公司），细胞培养瓶和培养板（美国Corning公司），抗人总EGFR抗体、磷酸化抗人EGFR抗体、抗人总Stat3抗体、磷酸化抗人Stat3抗体、预染SDS-PAGE低分子量Marker、发光Marker、山羊抗兔二抗、HRP标记的山羊抗鼠二抗（美国Cell Signaling公司），BCA蛋白定量试剂盒（美国Pierce公司），牛血清白蛋白（BSA）（杭州天象人公司）。

1.2检测方法[8]

1.2.1 细胞增殖抑制采用CCK-8法检测  对数生长期PC-9/GR细胞，胰酶消化，离心，取96孔培养板，每孔加入100 μL细胞悬液，置37℃、饱和湿度、5%CO2孵箱静置培养24 h，分别加入不同浓度的葫芦素B（终浓度为10 nmol/L、100 nmol/L、1000 nmol/L）的新鲜培养基，每一浓度重复3孔，设试剂对照组及细胞对照组，置37℃、饱和湿度、5%CO2孵箱静置培养;72 h后每孔加CCK-8溶液20 μL，继续培养2 h，酶标仪上450 nm处测OD值，按下述公式：存活率=（A实验组-试剂对照组）/（A细胞对照组-试制对照组）×100%，计算每一浓度的存活率。

1.2.2 细胞周期检测采用PI染色法檢测  对数生长期PC-9/GR细胞，0.25%胰蛋白酶消化、离心，按5×105/mL细胞浓度制成细胞悬液。取细胞悬液接种至6孔培养板，每孔12 mL细胞悬液，置于37℃、5%CO2培养箱内培养;培养24 h，更换新鲜培养基，加入不同浓度的葫芦素B至终浓度分别为10 nmol/L、100 nmol/L、1000 nmol/L及DMSO对照，置于37℃、5%CO2培养箱内分别继续培养24 h、48 h;经离心、调整，最后避光染色30 min后流式细胞仪上机检测，Multicycle软件进行DNA分析。

1.2.3 磷酸化和总EGFR、B-Actin、Stat3及Jak2的表达采用Westen-blot（免疫印迹法）检测  对数生长期PC-9/GR细胞，0.25%胰蛋白酶消化、离心，按5×105/mL细胞浓度制成细胞悬液，取10 mL细胞悬液接种至10 cm培养皿中。待细胞生长至80%汇合时，换用含10 nmol/L、100 nmol/L、1000 nmol/L葫芦素B及DMSO对照的完全培养基培养，继续培养6 h，分别提取总蛋白进行免疫印迹检测磷酸化及总EGFR、Jak2、Stat3、B-Actin的表达。

1.3 统计学方法

所有实验结果采用均数±标准差（x±s）表示，采用t检验及方差分析，并使用SPSS13.0软件进行统计学的进一步分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各种浓度葫芦素B对PC-9/GR细胞作用不同时间后检测细胞增殖抑制率和G2/M期阻滞率

葫芦素B能够对PC-9/GR细胞增殖和G2/M期细胞周期阻滞起明显抑制作用，且这种抑制作用呈浓度依赖性，随着浓度的增加，其对细胞周期阻滞活性、细胞增殖抑制也出现相应增强，各组间对比，差异具有统计学意义（P<0.05）;当葫芦素B浓度高于100 nmol/L时，葫芦素B对PC-9/GR细胞的增殖抑制和细胞周期阻滞活性具有时间依赖性。随着时间的延长，其抑制以及阻滞活性明显加强，各组之间差异具有统计学意义（P<0.05）;其中用1000 nmol/L浓度的葫芦素B处理48 h后，观察到葫芦素B对PC-9/GR细胞的增殖和细胞周期阻滞活性的抑制作用最强。细胞增殖抑制和细胞周期阻滞分别为（65.56±3.98）%和（57.34±3.92）%。见表1、2。

2.2 PC-9/GR细胞分别经三种浓度的葫芦素B作用及作用6 h后分析

采用Western blot法检测葫芦素B不同浓度对PC-9/GR细胞EGFR、Jak2/STAT3信号转导分子表达的影响，PC-9/GR细胞分别经三种浓度的葫芦素B（分别为10 nmol/L、100 nmol/L和1000 nmol/L）作用后，随着葫芦素B浓度的增加，其抑制p-Jak2、p-STAT3的表达作用越强，但对p-EGFR激活以及总EGFR、Jak2、STAT3的表达影响不明显（图1）。

PC-9/GR细胞分别经三种浓度葫芦素B（分别为10 nmol/L、100 nmol/L和1000 nmol/L）作用6 h后，检测EGFR、Jak2/STAT3（Westen-blot法）信号转导分子激活的程度，观察到P-Jak2、p-STAT3表达是无活性的，并且具有浓度依赖性，而p-EGFR是持续的。

3 讨论

葫芦素B（cucurbitacin B）是从葫芦科等植物中取得的，经过提取分离，已被证实具有多种药理活性。上世纪，我国已经研发出葫芦素B含量为60%的葫芦素B/E单体复合制剂，其广泛用于肝炎以及原发性肝癌的治疗，其抗癌作用及其机制是近年研究的热点[9-10]。近几年国内许多外学者对葫芦素B 的抗各种肿瘤的作用进行了较全面的研究，发现其抗肿瘤作用是因为其对STAT3 转录因子的活化有较强的抑制作用，且与抑制STAT3 转录因子的持续活化有关[11-13]。Zhang M等[14]研究表明，葫芦素B能够抑制A549肺癌细胞中STAT3转录因子的活化，而且这种抑制作用呈浓度依赖性，从而诱导A549细胞凋亡。

STAT3作为癌基因，在各种类型的细胞及组织中有广泛表达，其在肿瘤细胞的增殖、生长、凋亡及肿瘤免疫微环境异常等的调节中发挥关键的作用，其在恶性肿瘤细胞中持续活化。目前发现，由于STAT3的活化水平在EGFR 突变的NSCLC 细胞中异常增高，因此，在EGFR 体细胞突变的NSCLC中，STAT3 的活化被认为是癌症发生的必要条件[15]。Choi S等[16]研究发现，在多种人体实体瘤中，由于STAT3 的持续激活，细胞凋亡抑制因子（包括Bcl-2、Bcl-xl、MCL-1）和细胞周期调控因子（包括C-myc、CyclinD1 等）的表达出现上调，从而刺激肿瘤细胞的增殖、阻碍凋亡，并导致肿瘤细胞对化疗药物的耐药。国内外的研究发现[17-19]，通过动物实验抑制STAT3 的活化，恶性黑素瘤、胃癌及卵巢癌等对化疗药物的敏感性明显提高。此外，有研究发现[20-21]，在各种耐药癌细胞中检测到STAT3 mRNA 水平在对化疗药物较敏感细胞中明显增高。Cao W等[22]研究证实，高三尖杉酯碱能够抑制IL-6/STAT3信号路径，STAT3的活化受到抑制，利用高三尖杉酯碱能够抑制吉非替尼耐药NCI-H1975细胞增殖和诱导其凋亡。Gao SP等[23]研究发现，在STAT3的激活启动时期发挥着关键的作用可能是EGFR的活化突变，而EGFR活化突变的NSCLC STAT3持续活化的主要调节因素是IL-6/STAT3/IL6自分泌/旁分泌环。但是，目前关于NSCLC中STAT3水平与吉非替尼耐药关联性的分子机制，我们的认识并不充分。

本研究显示，葫芦素B体外实验能够抑制PC-9/GR细胞的增殖并阻滞细胞周期G2/M期，这种作用呈浓度及时间依赖性，其机制与信号转导通路受抑制密切相关，其分子机制是由于EGFR活化突變非依赖性的Jak2/STAT3信号转导通路受到抑制;因此我们认为葫芦素B能够抑制吉非替尼耐药的NSCLC中异常激活的STAT3信号途径，从而诱导吉非替尼耐药NSCLC的凋亡，这种抑制具有选择性，此机制有可能产生行之有效的吉非替尼耐药NSCLC的分子靶向治疗新策略，从而解决吉非替尼耐药NSCLC治疗的瓶颈问题。

总之，通过葫芦素B的选择性抑制作用及其信号分子导向，抑制吉非替尼耐药NSCLC中异常激活的STAT3信号途径，诱导吉非替尼耐药NSCLC的凋亡，有可能产生有效而可行的吉非替尼耐药NSCLC的分子靶向治疗新策略，解决目前临床中吉非替尼耐药NSCLC治疗中的难题，为该疾病的治疗开创新的途径，为中药葫芦素片老药新用提供理论依据，通过葫芦酚B的选择性抑制作用及其信号分子指导，抑制吉非替尼耐药NSCLC中异常激活的STAT3信号通路。

[参考文献]

[1] Ulahannan SV，Brahmer JR. Antiangiogenic Agents in Combination with Chemotherapy in Patients with Advanced Non-Small Cell Lung Cancer[J]. Cancer Invest，2011，29（4）：325-337.

[2] Nguyen KS，Kobayashi S，Costa DB. Acquired resistance to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors in non-small-cell lung cancers dependent on the epidermal growth factor receptor pathway[J]. Clin Lung Cancer，2009，10（4）：281-289.

[3] J？覿nne PA. Challenges of detecting EGFR T790M in gefitinib/erlotinib-resistant tumours[J]. Lung Cancer，2008， 60（2）：S3-89.

[4] Kobayashi S，Boggon TJ，Dayaram T，et al. EGFR Mutation and Resistance of Non-Small-Cell Lung Cancer to Gefitinib[J]. N Engl J Med，2005，352（8）：786-792.

[5] Pao W，Miller VA，Politi KA，et al.Acquired resistance of lung adenocarcinomas to gefitinib or edotinib is associated with a second mutation in the EGFR kinasedomain[J].PLoS Med，2005，2（3）：e73.

[6] Kwak EL，Sordella R，Bell DW，et al. Irreversible inhibitors of the EGF receptor may circumvent acquired resistance to gefitinib[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2005， 102（21）：7665-7670.