盐胁迫对燕麦叶片生理指标和差异蛋白组学的影响

陈晓晶 刘景辉 杨彦明 赵 洲 徐忠山 海 霞 韩宇婷

内蒙古农业大学 / 内蒙古杂粮工程技术研究中心 / 全国农业科研杰出人才及其创新团队,内蒙古呼和浩特 010019

中国盐渍土总面积9913 万公顷,约占国土面积的 1.03%[1],全球大约20%的陆地面积和近一半的灌溉土地都受到盐影响[2]。盐渍化是全球面临的严峻问题之一,也是危害农业生产的主要因素,如何提高植物耐盐性,充分利用盐渍土已成为目前研究的重点。目前,蛋白组学分析已经成为揭示盐胁迫下表达差异的最佳策略之一。前人分析了盐胁迫条件下水稻、小麦、玉米、大麦等植物不同组织器官细胞和亚细胞结构蛋白质组变化特征[3],并已经在水稻[4-6]、小麦[7-8]等叶片中鉴定出404 种与盐胁迫相关蛋白质。燕麦作为粮饲兼用作物,具有耐盐碱、耐贫瘠、抗寒等特性,已成为改良盐碱地的先锋作物[9]。目前有关燕麦耐盐性的研究主要集中在生理生化指标、离子吸收及气孔排盐机制上[9-11],关于盐胁迫对燕麦蛋白质组学的影响鲜有报道[12]。在燕麦响应逆境胁迫领域开展蛋白质组学相关研究,为新的抗逆基因(或蛋白)的鉴定奠定了基础。非标定量法(Label-Free)是近年来重要的质谱定量方法,通过比较质谱分析次数或质谱峰强度,分析不同来源样品蛋白的数量变化来提高低丰度蛋白质的检测效率和蛋白质定量的准确性。本试验运用Label-Free 技术,对比研究对照与处理间差异蛋白的变化及涉及的功能,旨在挖掘响应盐胁迫相关的蛋白,明确参与燕麦耐盐过程的相关代谢通路,为作物抗盐育种提供更有效地科学依据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验设计

2017—2018年,在内蒙古农业大学燕麦产业研究中心温室,选用吉林省白城市农业科学院选育的白燕5 号开展盆栽试验。设对照(BYC)及盐胁迫(BYS)2 个处理,每10 桶为一次重复,每个处理重复3 次,共60 桶。每桶播30 粒种子至装满配置基质(沙土∶蛭石∶陶粒 = 3∶1∶2)的塑料桶(桶上径24 cm、下径22 cm、高25 cm),出苗后间苗至20株。每桶底部钻5 个直径4 mm 圆孔渗水透气。每周浇Hogland 营养液3 次,每次250 mL。于燕麦三叶期对燕麦进行150 mmol L-1盐胁迫处理(按摩尔浓度NaCl∶Na2SO4= 1∶1 混合溶于营养液)6 d,对照浇相同体积营养液,在燕麦分蘖期分别取BYC 与BYS 处理各重复倒三叶叶片共2 g 至1.5 mL冻存管中,液氮速冻,-80℃保存用于蛋白质组学分析。

1.2 常规指标测定与方法

采用硫代巴比妥酸法[13]测定丙二醛(MDA)含量；用氮蓝四唑(NBT)光还原法测定[14]超氧化物歧化酶(SOD)活性；用愈创木酚法测定[13]过氧化物酶(POD)活性；用磺基水杨酸提取法[15]测定游离脯氨酸(Pro)含量。

1.3 燕麦叶片总蛋白的提取

将冻存待测的样本用液氮预冷的粉碎器粉碎。用液氮研磨粉碎后的粉末。将粉末按照1∶10(w/v)加入Lysis buffer 涡旋混匀。以0.2 s on、2 s off,振幅22%超声60 s。室温提取30 min。15,000 ×g10℃离心1 h,取上清液,分装后冻存于-80℃。

1.4 蛋白定量

采用Bradford 法[16]测定样本所提取的蛋白浓度。根据曲线公式计算各样品蛋白浓度(μg μL-1)。具体操作步骤见程德金等[17]的研究。

1.5 蛋白酶解(filter aided sample preparation,FASP)

蛋白定量后取200 μg蛋白溶液置于离心管。加入DTT,使终浓度为25 mmol L-1,60℃反应1 h。加入碘乙酰胺,使终浓度为50 mmol L-1,室温10 min。将还原烷基化后的蛋白溶液加入10 K 超滤管,12,000 ×g离心20 min,弃掉收集管底部溶液。加入Dissolution buffer 100 μL,12,000 ×g离心20 min,弃掉收集管底部溶液,重复3 次。更换新的收集管,在超滤管中加入胰蛋白酶,总量4 μg(与蛋白质量比为1∶50),体积50 μL,37℃反应过夜。次日,12,000 ×g离心20 min,酶解消化后的肽段溶液离心收集于管底部。在超滤管中加入50 μL Dissolution buffer,12,000 ×g再次离心20 min,与上步合并,收集管底部共得到100 μL酶解后的样品。冻干待上样。

1.6 纳升级反相色谱-Q Exactive 进行蛋白质分析

将高 pH 反相分离得到的组份用20 μL 2%甲醇和0.1%甲酸复溶。12,000 ×g离心10 min,吸取上清液上样。上样体积10 μL,采取夹心法上样。Loading Pump 流速350 nL min-1,15 min。分离流速300 nL min-1。

1.7 质谱数据分析

使用数据库uniprot-Pooideae361804_20170619.fasta.fasta(362,934 sequences)。质谱分析是由Thermo Q Exactive 型质谱完成,可信度在 95%以上的谱肽(Peptide Spectrum Matches,简称PSMs)为可信PSMs,至少包含一个unique 肽段(特有肽段)的蛋白为可信蛋白,只保留可信的谱肽和蛋白,并做FDR 验证,去除FDR 大于1%的肽段和蛋白。在比较的样品对之间,将蛋白在不同重复组中差异倍数的均值作为2 个样品的差异倍数,并做T-test 检验得到P-value,以此作为显著性指标。

1.8 数据处理及生物信息学分析

采用Microsoft Excel 2003 和SAS 9.0 软件统计分析数据。对鉴定到的蛋白进行常见功能数据库注释,包括COG、GO 和KEGG 数据库；最后针对筛选出来的差异蛋白进行GO、KEGG 功能富集分析等一系列的差异蛋白功能分析。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对游离脯氨酸、抗氧化酶活性、及丙二醛的影响

MDA 是脂质过氧化的产物,是细胞膜稳定性的标志物；SOD 和POD 在活性氧(ROS)清除中起重要作用；植物体内Pro 含量在一定程度上反映了植物的抗逆性,由图1可知,BYS 处理的MDA、SOD 活性均呈下降趋势,分别较BYC 降低16.7%和23.4%,但无显著差异。POD 较BYC 显著降低21.2%,Pro 含量变化不明显,较BYC升高了1.12%。

2.2 盐胁迫下差异表达蛋白质筛选

在相对定量时,将两个样品蛋白丰度比定义为差异倍数。本研究以蛋白质差异倍数大于2 且经统计检验其P-value值小于0.05 时,视为上调蛋白；以差异倍数小于0.5 且经统计检验其P-value 值小于0.05 时,视为下调蛋白。将BYS 和BYC 比较,得到差异表达蛋白76 个,其中51 个蛋白上调表达,25 个蛋白下调表达。对每个蛋白差异倍数以2 为底取对数后作出分布如图2,表达量上调的蛋白居于横坐标0 位置的右侧,表达量下调的蛋白居于横坐标0位置的左侧。

2.3 盐胁迫下差异表达蛋白质聚类分析

由图3可知,不同蛋白在不同样品间的上调、下调情况,且两组样品中3 次重复样品间的相似性极高,说明筛选差异蛋白的合理性；76 个差异蛋白通过COG 数据库有62 个差异蛋白可被注释并进行功能分类(表1)。

图1 盐胁迫对抗氧化酶活性的影响 Fig.1 Effect of salt stress on antioxidant enzyme activity

图2 差异蛋白火山图 Fig.2 Differential protein volcano map

图3 差异蛋白聚类热图 Fig.3 Differential protein clustering heat map

表1 BYC 与BYS 差异蛋白 Table1 BYC and BYS differential proteins

(续表1)

2.4 GO 注释与GO 富集分析

如图4所示,对76 个差异蛋白通过GO 注释到27 个,显著富集 16 个代谢路径,主要表现在氧化还原过程(oxidation-reduction process)33.9%；氧化还原酶活性(oxidoreductase activity)28.6%；氧化还原酶活性,作用于供体的 CH-OH 基团,NAD 或 NADP 作为受体(oxidoreductase activity,acting on the CH-OH group of donors,NAD or NADP as acceptor)7.1%；未折叠的蛋白质结合(unfolded protein binding)5.4%。从细胞组分(cellular component)、分子功能(molecular function)以及生物过程(biological process)这三个方面分类,在细胞组分没有成分发生变化；分子功能有10 个成分发生变化,其中level 3 统计富集的生物学过程有2 个,分别为氧气结合(oxygen binding)和氧化还原酶活性(oxidoreductase activity)；生物过程有6 个成分发生变化。

图4 差异蛋白GO 富集结果 Fig.4 Differential protein GO enrichment results

2.5 KEGG 注释与KEGG 富集分析

在盐胁迫过程中,蛋白功能的行使是依靠多个蛋白的协同作用,导致大量蛋白发生明显变化。而通路分析可以更全面、更系统地了解每个蛋白的生物学过程及应对盐胁迫的机制。通过KEGG 富集,76 个差异蛋白中有22 个差异蛋白显著富集10个生化代谢途径,如图5所示,分别为β-丙氨酸代谢(beta-Alanine metabolism)、长寿调节途径(Longevity regulating pathway-multiple species)、抗原处理和呈现(Antigen processing and presentation)、内质网中的蛋白质加工(Protein processing in endoplasmic reticulum)、雌激素信号通路(Estrogen signaling pathway)、维生素B6代谢(Vitamin B6 metabolism)、氯代烷烃和氯代烯烃降解(Chloroalkane and chloroalkene degradation)、精氨酸和脯氨酸代谢(Arginine and proline metabolism)、柠檬烯和蒎烯降解(Limonene and pinene degradation)、沙门氏菌感染(Salmonella infection),且Protein processing in endoplasmic reticulum、 Longevity regulating pathway-multiple species、Antigen processing and presentation 和Estrogen signaling pathway 这4 个途径在盐胁迫条件下发生了非常显著变化。

2.6 差异蛋白质互作调控网络

76个差异蛋白通过String在线软件(http：//www.string- db.org/)构建蛋白质互相作用调控网络,并隐藏没有相互作用的蛋白,得到21 个差异蛋白共建立50 种互作关系,如图6所示,与蛋白质F2DYT5 互作的蛋白数最多,有6个；有4 个蛋白质与F4Y589 和A0A1D5SA32 互作；均有3 个蛋白质与 I1GZ93、I1GU32、W5EGU4、I1IF07、M0Y631、A0A1D5Y3B7 互作；2 个蛋白质与A9LIN4、I1IU29、A0A1D5S6L5、I1J3C6、Q3I0N4、F2E3N4 互作；仅有一个与之互作的蛋白质有I1GM81、A0A1D6AN16、O65195、Q8S311、G8CLP1 和I1HU73。

3 讨论

植物抗盐性指标是研究植物抗盐机理和能力的基础,MDA 间接表示膜受损状况,且有反馈作用[18]。高彩婷等[19]发现高盐胁迫24 h 燕麦叶片MDA 含量最高,之后迅速下降。本研究盐胁迫6 d MDA 含量下降,可能是长时间胁迫造成的。SOD、POD 在植物体内活性氧清除过程中起重要作用[20]。周莹等[21]研究表明,SOD 活性随NaCl 浓度升高呈先增后降趋势,POD 活性呈逐渐下降趋势。本试验中,150 mmol L-1为燕麦忍受盐胁迫的临界浓度[22],SOD、POD 活性均降低,与前人研究结果一致,且SOD 活性的变化规律也反映了与其相关蛋白I1I9J4 的表达情况,在盐胁迫下呈下调表达。前人研究表明草木樨幼苗在NaCl 胁迫下,产生更多的Pro 维持细胞渗透平衡[23]。本试验与其结果一致,盐胁迫下燕麦叶片Pro 含量增加。

通过比较CK与盐胁迫处理蛋白质变化,共鉴定到76个差异蛋白,通过GO 显著富集16 个代谢途径,KEGG 显著富集10 个代谢途径；COG 数据库注释得到62 个差异蛋白分属于不同蛋白质家族,包含11 个丰富的代谢途径,这与ZHAO[24]研究结果相似。其中翻译后修饰、蛋白质周转、分子伴侣等功能包含最多的差异蛋白质,为15 个,且除M0Y631 外全部上调。蛋白质互相作用网络图表明大部分蛋白来自这一代谢途径,表明盐胁迫下燕麦通过合成大量蛋白来抵御逆境[25]。本研究鉴定的差异蛋白质中,有9 个与分子伴侣相关,4 个与蛋白质周转相关,2 个与蛋白质翻译后修饰相关。分子伴侣蛋白不仅对蛋白质前体的转运起重要作用[26],还能调控蛋白质折叠、积累及其定位和降解[27-30]。本研究鉴定的9 个分子伴侣相关蛋白均属热激蛋白,在盐胁迫条件下 8 个上调,且与 F2DYT5、F4Y589 互作的蛋白数最多。Hamilton 等[31]研究发现玉米就是通过合成热激蛋白应对高盐胁迫对其造成的伤害。Ribosomal 是蛋白质合成的主要“工厂”,在mRNA 翻译成多肽的过程中起重要作用[12]。本试验中F2DBP2 上调,推测其与热激蛋白的合成有关。

图5 差异蛋白KEGG 富集结果气泡图 Fig.5 Bubble diagram of differential protein KEGG enrichment results

图6 蛋白质互相作用网络图 Fig.6 Protein interaction network diagram