LOXL-2在结直肠癌中的表达及与预后的COX回归分析*

赖国威， 郑锐年， 廖玉婷， 赵继红

东莞市人民医院 1普外科， 2肿瘤内科， 3病理科(广东东莞 523059)

结直肠癌是严重危害人类健康的消化道恶性肿瘤。根据2012年GLOBOCAN公布数据显示，全球范围内，每年结直肠癌新发病例数为136万，死亡病例数为69万[1]。近年来，随着社会经济的快速发展，居民生活方式和饮食结构西方化，我国结直肠癌发病率持续上升[2]。鉴于目前我国肠癌早期筛查尚未普及，相当一部分患者就诊时已属中晚期。尽管外科手术和放化疗方案不断优化，但晚期结直肠癌的生存率改善不明显。结直肠癌患者治疗失败的主要原因是肿瘤侵袭和转移，因此，探索肿瘤侵袭和转移的新机制相当重要，从而，鉴定新的预后生物标记物可以为结直肠癌的靶向治疗提供新的方向。赖氨酰氧化酶样蛋白-2(lysyl oxidase like-2 protein, LOXL-2)属于赖氨酰氧化酶家族成员。既往对赖氨酰氧化酶的研究主要集中在催化细胞外基质、胶原、弹力蛋白等方面[3-4]。新近研究表明，LOXL-2在参与调控新生血管形成、细胞分化、肿瘤侵袭和转移等过程中亦起重要作用[5-6]。此外，LOXL-2的高表达与生存期缩短等预后差有关。这些数据引起了许多研究者的兴趣，他们已经确定LOXL-2是开发用于有效肿瘤治疗抑制剂的强有力的候选目标。但关于LOXL-2在结直肠癌组织中的表达水平与临床病理参数的关系，以及其与预后的相关性仍需要进一步确认。本研究旨在探讨LOXL-2在结直肠癌中与临床病理参数及与预后的关系，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2005年1月至2010年12月东莞市人民医院胃肠外科结直肠癌手术患者的癌组织标本及癌旁正常结直肠黏膜标本85例，其中伴淋巴结转移癌组织35例。所有纳入患者术前未接受放化疗，术后经病理诊断证实。依据AJCC第7版TNM分期对患者进行病理分期。本研究得到东莞市人民医院医学伦理委员会批准，研究对象均已签署知情同意书。

1.2 实时荧光定量PCR 分别使用RNAiso Plus和RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit提取组织总RNA和合成cDNA。建立25 μL的PCR反应体系。PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35个循环，72℃延伸10 min。LOXL-2上、下游引物序列分别为5′-CACCCACTATGACCTGCTGA-3′和5′-TCTTCTGGATGTCTCCTTCACA-3′；GAPDH上、下游引物序列分别为5′-TGAACGGAAGCTCACTG-3′和5′-GCTTCACCACCTTCTTGATG-3′。

1.3 免疫组化染色 采用EnVision法检测标本中LOXL-2的表达情况。一抗购自美国Abcam公司的山羊抗人LOXL-2多克隆抗体(1∶500稀释)。采用Dako公司EnVisionTM+System试剂盒进行二抗标记和显色。采用文献报道的常用的评分方法，阳性细胞比例分为：无=0;<10%=1; 10%～50%=2; 51%～80%=3;>80%=4，染色强弱分为：无=0; 弱=1; 中=2; 强=3，根据两者的乘积进行免疫反应评分，按照评分分值，判断为阴性(0～3)、低表达(4～6)、中表达(7～9)和高表达(10～12)。

1.4 统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件，采用Chi-square检验分析计数资料组间差异及LOXL-2表达与临床病理参数关系。采用t检验分析qPCR结果。LOXL-2的表达及与预后行Cox回归分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LOXL-2 mRNA在结直肠癌中的表达情况 qPCR结果显示，在结直肠癌组织和淋巴结转移癌组织中LOXL-2 mRNA的表达量分别为0.782±0.091和0.871±0.086，而在邻近正常肠黏膜组织中LOXL-2 mRNA的表达量为0.215±0.073。LOXL-2 mRNA在结直肠癌组织和淋巴结转移癌组织中的表达量高于邻近正常肠黏膜组织(P<0.05)。

2.2 LOXL-2蛋白在结直肠癌中的表达情况 免疫组化染色结果显示，LOXL-2 在正常肠黏膜组织、结直肠癌组织和淋巴结转移癌组织中均有表达，且表达强度呈递增趋势(表1)。其中LOXL-2 在结直肠癌组织和淋巴结转移癌组织中的表达与邻近正常肠黏膜组织相比差异具有统计学意义(P<0.05)。结直肠癌肿瘤组织中的LOXL-2的表达阴性和阳性代表图见图1。

表1 LOXL-2在正常肠黏膜组织、结直肠癌组织和淋巴结转移癌组织中的表达 例

*与正常肠黏膜组织比较P<0.05

2.3 LOXL-2蛋白的表达与结直肠癌临床病理参数的关系 在入选的结直肠癌中，LOXL-2蛋白表达水平与患者的淋巴结转移和临床分期相关(P<0.05)，而与患者的性别、年龄、组织学类型等参数无明显的相关性(P>0.05)，见表2。

2.4 LOXL-2的表达与结直肠癌患者预后的关系 LOXL-2高表达的患者其3年和5年总体生存率(OS)分别为77.6%和55.9%，LOXL-2低表达患者3年和5年OS分别为88.7%和66.6%，差异有统计学意义(P=0.037)，见图2。

2.5 LOXL-2的表达与预后的Cox回归分析 单因素分析结果显示，高水平表达的LOXL-2与结直肠癌患者的OS显著相关(HR=4.312,95%CI：1.598～8.220，P=0.006)，同时淋巴结转移数与OS显著相关(P<0.05)；多因素分析结果显示，LOXL-2和淋巴结转移数是OS(HR=3.368，P=0.007;HR=2.457，P=0.013)的独立预后因素，见表3。

A：LOXL-2表达阴性；B：LOXL-2表达阳性

3 讨论

结直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一。根据2017年国家癌症中心发布的数据，城市地区结直肠癌在男性肿瘤发病率中居第5位，在女性中居第3位。尽管临床治疗方式不断进步，但是，中晚期结直肠癌的死亡率仍然改善不明显。主要原因是肿瘤的侵袭和转移导致结直肠癌复发和死亡。结直肠癌的侵袭和转移是一个多因素、多阶段、多步骤的复杂过程，涉及细胞外基质的溶解、细胞黏附性降低和细胞游走等多个环节及众多基因的异常表达调控[7-10]。

赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase LOX)家族由5个成员组成，一些成员最近成为肿瘤进展的重要调控因子。其中LOXL-2是目前最典型的LOX，也是研究最全面的成员。LOXL-2是一种分泌型铜依赖性氨基酸氧化酶，主要通过催化赖氨酸残基的肽基氧化脱氨，促进共价蛋白的交联，参与细胞黏附、迁移、上皮间质转化等病理生理过程。随着研究的深入，学者们越来越多关注LOXL-2在参与调控肿瘤血管生成、肿瘤侵袭和转移等过程中的作用[11-12]。Kirschmann等[13]研究发现LOXL-2在高侵袭性的乳腺癌细胞株中的表达明显高于低侵袭性的乳腺癌细胞株，提示LOXL-2在乳腺癌的侵袭、转移过程中发挥重要作用。Peng等[14]研究发现，LOXL-2能够诱导胃癌细胞侵袭和转移能力增强，应用LOXL-2特异性抗体作用后胃癌的生长和转移受到显著抑制。在胰腺癌中，LOXL-2表达明显上调并参与了胰腺癌抵抗吉西他滨的过程[15]。近年研究发现，LOXL-2主要通过激活Snail/Ecadherin通路或Src/FAK通路参与肿瘤侵袭和转移[16-17]。LOXL-2通过下调Snail，抑制钙黏蛋白E(E-cadherin)的表达，E-cadherin是上皮-间质转化(EMT)的标志性蛋白，EMT被认为是肿瘤演进的重要过程。此外，LOXL-2在胃癌、头颈部鳞状细胞癌中与肿瘤分化以及淋巴结转移密切相关，可作为预后预测的新型标志物[18]。LOXL-2首次被描述为喉部鳞状细胞癌的预后标志物[19-22]。Peinado等[23]通过免疫组织化学方法研究了LOXL-2在256例人喉鳞状细胞癌中蛋白表达情况,并发现了LOXL-2表达增加与局部复发增加相关，此外，高表达LOXL-2与喉鳞状细胞癌、肺鳞状细胞癌和淋巴结阴性乳腺癌患者的总生存期和无病生存缩短有关。随后的多项研究表明，LOXL-2高表达或过表达与胃癌[21]、结肠癌[22，24]、基底样乳腺癌[25]、胰腺癌[20]和肝细胞癌[21]的预后差、生存率降低有关。

表2 85例结直肠癌组织中LOXL-2的表达与临床病理参数的关系 例

LOXL-2表达与OS的生存分析，与LOXL-2低表达组相比，LOXL-2高表达组的OS更差(P<0.01)

图2 LOXL-2表达对结直肠癌患者预后的影响

表3 LOXL-2的表达与OS的Cox回归分析

在本研究中，我们通过荧光定量PCR和免疫组化染色技术对85例结直肠癌临床样本进行研究发现，LOXL-2在结直肠癌组织和淋巴结转移癌组织中的表达水平显著高于正常肠黏膜组织(P<0.01)，而且LOXL-2与结直肠癌患者的临床分期和淋巴结转移等参数相关，提示LOXL-2可能在结直肠癌的侵袭、转移过程中发挥作用。最后本研究通过Cox回归分析探讨了LOXL-2对结直肠癌患者预后的影响，经过调整各项协变量后，得到了结直肠癌组织中LOXL-2高表达明确为结直肠癌患者预后差的风险因素。上述研究结果提示LOXL-2的异常表达在结直肠癌的恶性演进过程中可能起重要作用，有可能作为预防和治疗结直肠癌转移的新靶点。

综上所述，LOXL-2的表达与结直肠癌患者的淋巴结转移及肿瘤分期密切相关，结直肠癌组织中LOXL-2高表达为结直肠癌患者预后差的风险因素。