新抑癌基因INPP4B在EB病毒相关胃癌中的表达及其临床意义

马艺文，谭继超，张宇，代伟宏，张瑜，林荣锦，罗阳，徐岩

（1.中国医科大学附属第一医院胃肠肿瘤外科，沈阳 110001；2.宝鸡市中心医院乳腺科，陕西 宝鸡 721008；3.中国医科大学生命科学学院医学基因组学教研室，沈阳 110122）

磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidyinositol 3-kinase，PI3K）/Akt信号转导通路是膜受体信号向细胞内转导的重要途径，在维持细胞生存和抑制细胞凋亡中起关键作用。PI3K活化而产生的类脂产物3，4-二磷酸磷脂酰肌醇［PI（3，4）P2］和3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇［PI（3，4，5）P3］作为第二信使，通过磷酸化激活Akt蛋白，调节多个下游靶蛋白，如Caspase9，核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB），GSK3等，从而促进细胞的增殖，抑制凋亡。PI3K/Akt信号通路异常活化，是肿瘤细胞的重要特征之一。这往往是由于PI3K/Akt信号通路的负性调节因子功能失活造成的。重要的抑癌基因PTEN就是PI3K/Akt信号通路中重要的负性调节因子［1］。INPP4B基因也在抑制PI3K/Akt信号通路方面发挥重要的作用，但其在胃癌中的功能尚不清楚。EB病毒相关胃癌是肿瘤细胞内存在EB病毒感染的一类胃癌，约占胃癌总数6%～15%［2］。虽然，PIK3CA突变以及DNA超甲基化等是EB病毒相关胃癌的分子生物学特征，但人们对EB病毒相关胃癌的认识才刚刚开始。本研究拟通过检测INPP4B蛋白在胃癌中的表达情况，来探讨INPP4B与EB病毒相关胃癌的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

随机收集2001年3月至2007年7月在中国医科大学附属第一医院胃肠肿瘤外科手术治疗且病理资料完整的301例胃癌患者的石蜡包埋标本，并选取对应癌旁黏膜组织（距肿瘤边缘 ＞ 5 cm）作为正常对照。其中，男214例，女87例，年龄29～81岁（平均50.2岁），所有患者术前均未接受放疗或化疗。标本收集均经患者知情同意，本研究经医院伦理委员会批准同意。免疫组化一抗为兔抗人INPP4B单克隆抗体（英国Abcam公司）；二抗为SABC-POD兔二抗试剂盒（博士德公司）、DAB显色试剂盒（美国Boster公司）；用于EB病毒检测的EBER原位杂交探针、原位杂交试剂盒及封片剂（丹麦Dako公司）。

1.2 方法

1.2.1 病理组织学检查：石蜡包埋标本常规行4 μm切片，一张用于HE染色，进行病理学诊断。其余用于免疫组化染色和原位杂交实验。按照日本胃癌处理规约的标准判定病灶的分化程度和组织分型等，浸润深度和肿瘤分期的判定则依据2010年第八版TNM分期系统。

1.2.2 免疫组织化学染色：采用过氧化物酶标记的链霉素卵白素法，染色步骤按说明书进行。常规脱蜡，灭活内源性过氧化物酶，以及抗原修复。以5%BSA室温封闭后，一抗（1∶50）4 ℃过夜。二抗常温孵育20 min，DAB显色处理，苏木素复染，脱水封片。用PBS代替一抗，作为空白对照。正常的胃黏膜腺体均为INPP4B蛋白阳性表达，所以将其作为阳性对照。通过与相邻的正常胃腺体细胞相比较，来确定胃癌细胞中INPP4B的表达情况。以胞质中出现棕黄或棕褐色颗粒者为阳性细胞，每例随机观察10个高倍视野，每个视野计数100个细胞。阳性染色按照其强度分为+、++、+++。分析结果时，阳性定义为至少≥10%的肿瘤细胞呈+～ +++染色。最终根据癌细胞中INPP4B蛋白表达与其癌旁正常细胞对比情况，将癌细胞分为2组：表达下降组、正常表达或升高组。

1.2.3 EBER原位杂交：石蜡切片水化，蛋白酶K预处理，探针杂交55 ℃孵育1 h 30 min，55 ℃洗脱25 min，孵育抗体20 min后封片。以荧光素链接的核酸肽链探针为阳性对照，以荧光素链接的随机核酸肽链探针为阴性对照。根据染色结果分为EB病毒感染阳性及阴性2组。

1.3 统计学分析

应用SPSS 21.0统计软件进行统计分析，不同临床病理特征之间INPP4B蛋白表达比较采用χ2检验及Fisher确切概率法分析差异性，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织中INPP4B蛋白的表达情况

正常胃黏膜细胞中均有INPP4B蛋白的表达，尤其在腺体颈部和底部。而与其相对应的胃癌细胞中，INPP4B蛋白的表达则显著下降。本研究检测的301例胃癌标本中，有146例（48.5%）出现了INPP4B蛋白表达明显下降或阴性表达，见图1。

2.2 INPP4B蛋白表达与临床病理特征的关系

INPP4B蛋白表达与患者的性别、年龄、主癌位置、大体分型、浸润深度、肿瘤大小、淋巴结转移情况以及淋巴管癌栓等无关，而与肿瘤细胞的分化程度及生长方式则密切相关（P＜ 0.05）。低分化的胃癌细胞中INPP4B蛋白低表达的比例显著高于高中分化的胃癌细胞。与巢状及团块生长的胃癌组织相比，INPP4B在弥漫生长的胃癌组织中，更容易出现表达下降。见表1。

图1 免疫组化检测胃癌细胞中INPP4B蛋白表达Fig.1 Immunohistochemical result of INPP4B protein in gastric cancer

2.3 胃癌中EB病毒的感染状态

原位杂交探针检测肿瘤组织中的EB病毒EBER核酸分子，阳性信号定位于细胞核中，为深紫蓝色，染色较浓且均匀。在本研究检测的272例胃癌组织中，EB病毒感染的阳性比例为14.71%，见图2。

表1 INPP4B表达与胃癌临床病理特征的关系Tab.1 Correlation between clinical characteristics and INPP4B expression in patients with gastric cancer

2.4 胃癌中EB病毒感染与INPP4B蛋白表达的相关性

图2 胃癌组织中EB病毒原位杂交检测结果Fig.2 EBRB in situ hybridization for EB virus in gastric cancer

本研究分析了免疫组化检测的胃癌组织样本中有193例同样应用于原位杂交检测。提示INPP4B蛋白在胃癌组织中的表达降低与EB病毒感染显著相关（P＜ 0.05）。见表2。

3 讨论

多磷酸肌醇-4-磷酸酶Ⅱ型是不依赖Mg+的磷酸酶，可以使PI3K活化而产生的第二信使PI（3，4）P2，水解成PI（3）P，从而中断PI3K/Akt信号继续向下传导。由于INPP4B对PI3K/Akt信号通路具有显著调控作用，进而抑制细胞的增殖，目前认为INPP4B很可能是一个重要的抑癌基因［3］。研究表明，在乳腺癌［4］、结直肠癌［5］、前列腺癌［6］等恶性肿瘤中，INPP4B均有较高频率的表达下降，而且与患者的不良预后密切相关，尤其在转移性肿瘤中下降的程度更加明显。另外，研究［7］证实INPP4B的丢失可以异常增强PI3K/Akt信号通路，促进甲状腺癌的进展和转移。但是，INPP4B在胃癌中的表达情况尚不清楚。本研究利用免疫组化检测了301例胃癌组织中INPP4B蛋白表达情况，结果显示，在48.5%的胃癌组织中，出现了INPP4B蛋白表达下降。虽然INPP4B在低分化的胃癌中下降的频率更高，但其表达水平与肿瘤的分期和预后未见统计学差异。

表2 胃癌中INPP4B蛋白表达与EB病毒感染的相关性Tab.2 Correlation between INPP4B expression and EB virus infection in GC

进一步的分析发现，INPP4B蛋白表达下降与EB病毒感染阳性密切相关（P＜ 0.05）。EB病毒相关胃癌是一类特殊的胃癌类型，具有其独特的分子生物学特征及发病机制。2014年，美国癌症基因组图谱协作组根据细胞的分子生物学特点［8］将胃癌分为4种亚型：EB病毒感染阳性型，微卫星不稳定型，基因组稳定型以及染色体不稳定型。这4种胃癌亚型在流行病学、临床病理特征、分子表型及预后方面均有统计学差异。其中，EB病毒感染阳性型胃癌，以更广泛的DNA超甲基化，PIK3CA突变，PD-L1/2过表达，CDKN2A基因沉默等为主要特征。

值得注意的是，作为抑癌基因的INPP4B，启动子区域的超甲基化很可能是其失活的分子机制。有研究［9］发现，在被EB病毒感染的喉癌组织中，INPP4B启动子区域的超甲基化与INPP4B蛋白的表达下降密切相关。而且INPP4B的丢失持续增强PI3K/Akt信号，从而促进了肿瘤的进展。EB病毒的潜伏膜蛋白1可以诱导宿主细胞的甲基转移酶，从而改变宿主基因组的甲基化状态［10］。由EB病毒导致的基因组超甲基化状态，也可以导致某些抑癌基因的失活，进而引起宿主细胞的恶性转化［11］。

综上所述，本研究首次发现了INPP4B蛋白在胃癌组织中存在高频率的表达下降，而且INPP4B的表达下降与EB病毒感染密切相关。进一步研究INPP4B失活的具体机制将为揭示EB病毒相关胃癌的发病机制提供更深入的理论依据。