死后角膜数字图像变化与死亡时间关系的实验性研究

郑吉龙，霍德民，邓湘渝，腾月，王玖琳，单迪，贾儒林，钟浩鹏

（1.中国刑事警察学院法医学系法医病理教研室，沈阳 110035；2.上海市公安局嘉定分局刑侦支队，上海 201822；3.南昌市公安局刑侦大队，南昌 330000）

死亡时间（postmortem interval，PMI）推断一直是困扰法医学者们的难题之一。准确的PMI推断对于指导侦查工作方向具有重要意义。利用个体死后角膜变化推断PMI的做法由来已久，肉眼观察死后角膜混浊程度进而粗略估计PMI的方法由于主观性强且缺乏量化指标导致误差较大［1］。有学者探索通过测量死后角膜厚度变化［2-3］、分析死后角膜上皮和内皮细胞核酸降解程度［4-5］等推断PMI，但因破坏眼球组织结构及操作复杂，而未能实际应用。近年来，有研究［6-9］通过数字图像处理技术量化死后角膜数字图像变化，以期建立无创、客观地推断PMI的方法，但也因现场光源限制，图像阴影致局部失真，及角膜图像采集操作繁琐等未能得以应用。本研究应用自制的提供固定暗室条件并自带光源的便携式“死后角膜图像采集系统”，结合数字图像处理技术量化分析死后角膜图像颜色变化，并进一步验证了该方法于不同环境下推断PMI的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：健康成年新西兰大白兔40只，雌雄不限，体质量2.0～2.5 kg，购自沈阳医学院实验动物研究中心。给予充足淡水和食物，于20 ℃室内饲养。所有家兔眼部均未患疾病。

1.1.2 实验装置：本课题组研究设计并制作的“死后角膜图像采集系统”（图1）主要由智能手机（2 000万像素，分辨率5 120×3 840，华为Mate10，深圳华为终端有限公司）和附件装置组成。附件主体为一白色泡沫圆筒（内壁直径5.0 cm，高6.0 cm），内壁顶端固定一环形LED吸顶灯（冷光源，10 W，6 400 K色温，上海欧普照明股份有限公司），能输出强度均匀且恒定的光源，并可通过数据线接口连接移动电源（20 000 mAh，华为AP20Q，深圳华为终端有限公司）供电。圆筒顶端中央设一视窗，手机摄像头（白平衡、测光模式、曝光模式、对焦模式均设置为自动模式）刚好可透过该窗孔拍摄。圆筒开口端套有薄层环形海绵，以紧密贴合眶周。

图1 死后角膜图像采集系统示意图Fig.1 Schematic diagram of postmortem corneal image acquisition system

1.2 方法

1.2.1 动物分组：将家兔随机分为实验组（37只家兔，74只兔眼）和验证组（3只家兔，6只兔眼）。适应性饲养3 d后，采用缢死死亡模型［10］处死家兔。实验组家兔死后均置于温度20 ℃、湿度30%的避光室内；验证组3只家兔死后，随机编码为A、B、C，分别置于温度20 ℃、湿度30%的密闭暗室内（A）、密闭自然光照室内（B）及温度（20±5）℃、湿度30%～60%的密闭自然光照室内（C）。除采集角膜图像时，兔眼睑全程保持闭合状态。

1.2.2 图像采集与分析：死后72 h内每隔1 h采集家兔角膜图像，以jpg格式储存于手机中。每只兔眼各时间点分别采集3张图像。将角膜图像导入计算机，应用MATLAB软件［11］（R2013a，美国MathWorks公司）分割得到兔角膜瞳孔区域图像，并提取图像的红（red，R）、绿（green，G）、蓝（blue，B）、色调（hue，H）、饱和度（saturation，S）、明度（brightness，V）6项颜色指标数值［12］。每个时间点各指标数值取3张图像检测的平均值。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0软件分析缢死后兔角膜瞳孔区域图像的6项颜色特征参数与PMI的相关性，建立相关回归方程；分析与PMI相关性最高的参数在相同条件下的个体内及个体间差异，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

1.4 可行性验证实验

为验证“死后角膜图像采集系统”结合数字图像分析技术于不同环境下推断PMI的可行性，于验证组家兔死后72 h内每隔1 h进行角膜图像采集，再经图像分割及特征提取处理后，选择预先建立的判定系数最高的回归方程，分析得出PMI。每只兔眼每次采集3张图像，PMI预测值取3次测量的平均值，将推断的PMI与实际PMI进行配对t检验，用获得的标准差对盲测结果的准确率进行评价。盲测结果的准确率以差值的绝对值在标准差范围内为准。

2 结果

2.1 角膜图像颜色特征参数与PMI的回归分析

回归分析结果如表1所示，R、G、B与PMI相关性较强，经方差检验均有统计学意义，其中R与PMI的相关性最好；H、S、V与PMI相关性较差，经方差检验均无统计学意义。

2.2 个体内及个体间的差异分析

从实验组37组实验样本数据中随机抽取4组，用于分析相同条件下R值在个体内及个体间的差异性。结果显示，死后72 h内，同一个体内及不同个体间兔角膜瞳孔区域图像的R值随PMI延长均呈上升趋势，死后20 h内，R数值变化趋势较为平缓，20 h后变化较为迅速（图2～3）。不论个体内或个体间，不同PMI的R值之间有统计学差异（P＜ 0.01）；而相同死后时间的同一个体内及不同个体间的R值差异并无统计学意义（P＞ 0.05）。

表1 死后72 h内家兔角膜瞳孔区域图像6项颜色特征参数与PMI的回归方程Tab.1 Regression equations between PMI and six color features in the corneal pupil region images of rabbits within 72 hours after death

图2 同一样本内左、右角膜瞳孔区域图像R值随PMI推移变化趋势比较Fig.2 Comparison of variation trend of R values in the left and right corneal pupil region images of the same sample with the prolongation of PMI

2.3 可行性验证实验结果

由于R值与PMI相关性最高，且在相同条件下R值在个体内及个体间差异均无统计学意义，故选择反映R与PMI相关性的回归方程用于验证实验。结果如表2所示，A组与B组PMI预测结果基本一致，预测标准差均在2 h以内，总体预测准确度达94%；C组PMI预测标准差在3.5 h以内，总体预测准确度达73%。此外，随着PMI延长，PMI预测误差范围也逐渐增大，且C组增大幅度明显高于A、B组。

图3 不同样本间角膜瞳孔区域图像R值随PMI推移变化趋势比较Fig.3 Comparison of variation trend of R values in the corneal pupil region images of the different samples with the prolongation of PMI

表2 可行性验证实验结果Tab.2 Results of feasibility verification experiments

3 讨论

智能手机数字图像是采用数码技术与照相摄影技术的完美结合体［13］。但光线强度、拍摄角度与高度的变化及手机图像采集器的像素等都会最终影响拍摄图像的色彩，从而对后续色彩定量分析结果产生较大影响。本研究采用的“死后角膜图像采集系统”限制了手机图像采集器配置，统一采用华为智能手机（2 000万像素，分辨率5 120×3 840，华为 Mate10），且图像采集过程中固定手机相关拍摄参数（白平衡、测光模式、曝光模式、对焦模式均设置为自动模式）。为保证现场采集角膜图像的真实性和准确性，死后角膜图像采集系统由智能手机及附件部分组成，附件包括带有光源的泡沫圆筒及移动电源。泡沫圆筒高6.0 cm，属于微距拍摄的最理想高度范围［14-15］，以便采集角膜图像细节特征。筒顶部正中视窗刚好容纳智能手机摄像头，图像采集时角膜位于视窗下方正中央，保证了图像都在同一曝光条件、同一高度及角度下获得。圆筒内部顶端环形LED灯管较线形灯管更能保证覆盖眼表的光线强度均匀，避免于背光侧形成阴影导致图像差异。研究发现，该系统携带方便、操作简单，摄取数字图像的像素也符合分析要求，适用于现场实时动态采集个体死后角膜数字图像。

本研究发现，兔死后72 h内，反映角膜瞳孔区域图像变化的颜色特征参数R、G、B与PMI呈显著相关（P＜ 0.01或P＜ 0.05），其中R与PMI相关性最高（R2=0.935）；H、S、V参数值与PMI的关系均无统计学意义（P＞ 0.05）。分析其原因，一方面，实验用兔的角膜本身无色透明，但因眼底视网膜血管透过瞳孔反映在角膜上而呈淡红色。故在用数字图像颜色特征提取量化分析角膜混浊过程所致角膜瞳孔区域图像颜色变化时，反映出R指标较其他指标更为敏感，R值与PMI更具相关性；另一方面，由于兔角膜本身无色，死后角膜数字图像颜色的色调、饱和度、明度变化表达不明显，加之HSV颜色模型侧重于色彩表示，并不适于无彩色系类（黑、白、灰）的表达［16-18］，故H、S、V与PMI相关性较低。本研究还发现，相同条件下的个体内及个体间R数值差异无统计学意义（P＞ 0.05），表明R指标适合动态评价死后角膜图像颜色变化以推断PMI。

本研究还对不同环境条件下应用该方法推断PMI的可行性进行了验证实验，结果表明，尸体所处温、湿度条件的变化会导致PMI推断预测误差范围加大。分析其原因，可能是角膜混浊的发生与角膜内皮细胞的退化和角膜水分的蒸发有关，当尸体所处环境的温度、湿度发生变化时，会影响角膜混浊变化的进程［19-21］。而验证实验中均采用在预先固定的环境条件下获得的回归方程推断PMI，故当温、湿度升高时，该方法推断的PMI准确性会有所下降。提示法医学实践中利用死后角膜混浊变化推断PMI还应考虑尸体所处环境的影响。

综上所述，本研究组设计的便携式“个体死后角膜图像采集系统”结合数字图像处理技术，为现场采集角膜图像并推断PMI提供了一种客观的新方法。今后将进一步完善手机移动端的智能化设计，在角膜图像自动识别、人机交互界面开发、功能拓展等方面积极探索，以促进实现数字信息技术与传统法医学现场勘查、尸体检验等的深度融合。今后将继续丰富实验动物样本，探索不同环境温度、湿度条件下的死后角膜颜色变化的规律性，同时对尸体角膜图像进行采集与分析，积累数据，以期实现依据尸体角膜图像颜色变化分析推断PMI。