禽沙门菌分离鉴定方法的建立与优化

张富友 宋艳 崔治中 孙淑红

禽沙门菌分离鉴定方法的建立与优化

张富友 宋艳 崔治中 孙淑红*

（山东农业大学动物科技学院 山东 泰安 271018）

本研究旨在建立和优化禽沙门菌分离鉴定的方法。选择山东省某地方品种鸡疑似发生沙门菌病的未出壳死胚样品24份，通过4组不同的培养基组合比较沙门菌的分离情况，选择沙门菌通用引物两对和鸡白痢特异性引物一对进行分离株的PCR检测，比较其特异性，然后进行血清分型和MLST分型，确定沙门菌类型并研究其相关性。结果表明，该批样品中TTB比SC增菌效果好，XLD和XLT4选择培养基对沙门菌分离效果相同，最终通过PCR方法鉴定出沙门菌阳性率为58.3%；发现两对通用引物特异性一致，表明可任选一对引物进行PCR鉴定；用鸡白痢沙门菌特异性引物完成的PCR鉴定结果显示，14株沙门菌中有7株为鸡白痢沙门菌；血清型鉴定结果表明，14株沙门菌中有7株鸡白痢沙门菌、7株肠炎沙门菌，共两种血清型；MLST分子分型结果表明，14株沙门菌分为3个ST型，分别是7株ST11、3株ST92和4株ST2151，其中ST11为肠炎沙门菌，ST92和ST2151为鸡白痢沙门菌；本研究表明，疑似沙门菌感染样品经BPW和TTB增菌、XLD或XLT4选择培养基分离培养，最后通过PCR方法可准确完成沙门菌的分离鉴定；同时，应用该方法可完成对鸡白痢沙门菌的鉴定，并与血清分型和MLST分子分型结果一致。

禽沙门菌 PCR 血清型 MLST 相关性分析

禽沙门菌是一种革兰氏阴性菌，兼性厌氧。鸡感染沙门菌后会引发鸡沙门菌病，包括鸡白痢杆菌病、鸡副伤寒和鸡伤寒等病[1]。其中鸡白痢是国际动物卫生组织法定报告的B类传染病，也是我国农业部要求的重点检测的十四种动物疫病之一[2]。各种品种的鸡对沙门菌均易感，尤其是3周龄以内的雏鸡感染后，死亡率最高[3]。成年鸡感染呈慢性或阴性经过[4]。沙门菌传播途径广，主要经过种蛋传播，此外环境、饮水、饲料等污染后，可以造成鸡群感染[5]。沙门菌病一年四季均可发生，死亡率和造成的经济损失与鸡场净化程度和饲养管理水平密切相关[6]。

近年来沙门菌感染的事件频发，其中从鸡蛋和禽肉中都检测到沙门菌感染，威胁人类饮食安全和健康，同时沙门菌感染鸡群后，造成雏鸡死亡、育成鸡和成鸡生长发育迟缓，产蛋率下降等，给养殖业带来巨大的损失[7]。目前对沙门菌没有有效的治疗方法，只有通过净化淘汰阳性鸡，加强卫生检疫和管理，保护阴性群体等一系列措施，才能有效控制沙门菌造成的损害[8]。对于保种场，只能通过净化淘汰来保证鸡群的百分之百阴性[9]。本研究针对此问题建立并优化了沙门菌的检测方法，为沙门菌净化提供指导建议和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料来源 山东省某地方品种鸡疑似发生沙门菌病的未出壳死胚样品，共24份。

1.2 试剂 沙门菌属诊断血清购自宁波天润生物药业有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生物科技有限公司；胶回收试剂盒购自OMEGA公司；缓冲蛋白胨水(BPW)、四硫磺酸盐煌绿增菌液基础(TTB)、碘液、0.1%煌绿、XLT4琼脂均购自青岛海博生物技术有限公司；2×Taq Master Mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

1.3 分离培养 无菌取鸡胚肝脏、部分肠段样品，剪碎，加入BPW预增菌，37℃、220rpm/min培养12~18h，然后共分为四个组合，即分别用SC培养基和TTB培养基培养，37℃、220rpm/min培养18~22h，再分别用三线法接种到XLD和XLT4平板，37℃培养24~48h。

1.4 PCR鉴定 合成两对沙门菌通用引物FimW和invA以及鸡白痢沙门菌特异性检测引物ipaJ[10-12]，由睿博兴科生物技术有限公司合成，引物详情见表1。

表1 FimW和ipaJ引物序列及片段大小

从XLD和XLT4平板上分别挑取2~4个可疑菌落，接种到LB培养基中培养，用菌液作为模板，PCR扩增体系为25μl，其中2×PCR Master Mix(含有2×Taq DNA聚合酶、2×PCR Buffer和2×dNTP) 12.5μl、以可疑菌落LB增菌液为模板1μl、上下游引物(10pmol/μl)各1μl、ddH2O 9.5μl。FimW引物反应程序为：94℃ 5min(预变性)，94℃ 45s(变性)，50℃ 45s(退火)，72℃ 1min(延伸)，共35个循环，72℃ 7min(延伸)，4℃结束。invA引物反应程序为：95℃ 10min(预变性)，95℃ 30s(变性)，55℃ 45s(退火)，72℃ 45s(延伸)，共30个循环，72℃ 10min(延伸)，4℃结束。ipaJ引物反应程序为：94℃ 10min(预变性)，94℃ 45s(变性)，58℃ 45s(退火)，72℃ 1min(延伸)，共30个循环，72℃ 10min(延伸)，4℃结束。PCR扩增结束后取8μl用于电泳检测，用1%琼脂糖凝胶电泳，电压120V，电泳45min，以DNA Marker DL2000为参照用凝胶成像仪成像观察。

1.5 血清学鉴定 参考沙门菌属诊断血清试剂盒说明书进行沙门菌血清型的鉴定。

1.6 多位点基因序列分型(MLST) （1）MLST引物设计：参考MLST官方网站(http://mlst.Warwi ck.ac.uk/mlst/dbs/Senterica)上公布的七对管家基因的片段序列(aroC，dnaN，hemD，hisD，purE，sucA，thrA)，并由睿博兴科生物技术有限公司合成所需引物。引物序列见表2。（2）细菌DNA的提取：参考细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取沙门菌分离株的DNA。（3）PCR反应条件：PCR扩增体系为50μl，其中2×PCR Master Mix(含有2×Taq DNA聚合酶、2×PCR Buffer和2×dNTP) 25μl、DNA模板2μl、上下游引物(10pmol/μl)各2μl、ddH2O 19μl。反应程序：94℃ 5min(预变性)，94℃ 45s，55℃ 45s(退火)，72℃ 1min，共35个循环，72℃ 7min(延伸)，4℃结束。（4）PCR产物纯化：将PCR产物全部用于电泳检测，用1%琼脂糖凝胶电泳，电压120V，电泳45min，以DNA Marker DL2000为参照用凝胶成像仪成像观察，并将有目的片段的琼脂凝胶切下，装到预先准备好的离心管中，然后参考胶回收试剂盒说明书继续PCR产物的纯化。（5）测序及结果分析：将上述纯化后的PCR产物交于上海生物工程技术有限公司进行测序。下载沙门菌管家基因全部数据库，然后建立本地数据库，对测序结果剪切后进行序列比对，记录七对管家基因的等位基因数值，然后通过PubMLST网站查询ST型。

表2 沙门菌七对管家基因的引物序列

1.7 相关性分析 将菌落形态观察、PCR鉴定、血清学鉴定和MLST分子分型等结果进行相关性分析。

2 结果

2.1 分离培养结果 SC增菌液、TTB增菌液分别在XLT4和XLD两种选择培养基培养后，部分样品均出现无色半透明的菌落或有黑色中心的菌落(疑似鸡白痢沙门菌或其他沙门菌)，比例分别为13/24、13/24、14/24和14/24。结果表明，该批样品中TTB比SC增菌效果好，XLD和XLT4对沙门菌分离效果相同(表3)。

表3 不同培养基组合对沙门菌分离结果

2.2 PCR鉴定结果 用invA和FimW两对引物分别用PCR方法鉴定，结果表明：两对通用引物检测结果相同，可以随意任意选择一种使用(图1、2)；用ipaJ引物进行PCR方法鉴定，结果显示有7株鸡白痢沙门菌(图3)。

2.3 血清分型结果 平板凝集试验结果表明，14株沙门菌分为2种血清型，即肠炎沙门菌7株(50%)和鸡白痢沙门菌7株(50%)(表4)。

图1 用invA引物对部分菌株的PCR鉴定结果

图2 用FimW引物对部分菌株的PCR鉴定结果

图3 用ipaJ引物对部分菌株的PCR鉴定结果

2.4 多位点基因序列分型(MLST)结果 利用MLST技术对14株沙门菌分离株进行基因分型，14株沙门菌共有3种ST型，分别是ST11、ST92和ST2151，其中ST11为肠炎沙门菌(表4)，ST92和ST2151为鸡白痢。

表4 沙门菌分离株的ST型

2.5 相关性分析结果 XLT4和XLD培养基上有14个样品疑似沙门菌，其中有7个样品呈现有黑色中心的菌落形态，7个样品呈现无色半透明小菌落形态(疑似鸡白痢沙门菌)；PCR结果显示，有14株沙门菌，其中7株为鸡白痢沙门菌；血清学结果显示，14株沙门菌分为2种血清型，分别为7株肠炎沙门菌和7株鸡白痢沙门菌；MLST结果显示，14株沙门菌分为3种ST型，分别为ST11、ST92和ST2151，其中ST11为肠炎沙门菌，ST92和ST2151为鸡白痢沙门菌。通过对其相关性进行分析，发现菌落形态观察、PCR鉴定、血清分型和MLST分子分型结果一致。

3 讨论

（1）鸡白痢沙门菌在XLD和XLT4培养基上形态为无色半透明菌落，生长较慢，培养48h左右，菌落直径大约0.5㎜，其他沙门菌在该培养基上形态为有黑色中心的菌落，但是在密度较大的情况下，菌落没有黑色中心，并且存在其他形态类似的细菌干扰，因此，只从菌落形态进行判断有一定难度。考虑到鸡白痢沙门菌菌落比较小，通过挑取单菌落接种到LB培养基，更利于PCR结果准确性，并且方便分离菌株的保存。我们参照文献合成鸡白痢特异性引物，并进行验证，发现其可靠性较高，且快速方便。沙门菌属诊断学清可以通过检测沙门菌的抗原结构，从而判断血清型，但是由于结果需要眼观判断，主观性较强，存在误差。MLST分型作为一种分子分型技术，准确性高，但是需要对七对管家基因分别测序，对细菌DNA质量要求较高，并且需要对测序结果进行处理分析，综合七对管家基因的等位基因数值，通过网上数据对比确认相应菌株的ST型，由于ST管家基因存在点突变，ST会改变，因此不能只根据此结果判断菌株的分型。此外还有PFGE方法以及全基因组对菌株进行分型，但是成本高、操作难度大，目前只适用于科学研究。（2）本研究中，观察XLD和XLT4选择培养基上菌落形态，可以看到无色透明小菌落和有黑色中心的疑似沙门菌菌落，也存在一些透明但是正面观察呈现褐色的菌落干扰，显然，眼观判断不够准确；需补充PCR鉴定。本研究结果表明，经分离培养后，眼观判断可疑的菌落再选择沙门菌通用引物经PCR方法鉴定可完成沙门菌的分离鉴定，结果可靠、快速；该方法同样适用于鸡白痢沙门菌的分离鉴定。（3）血清型鉴定表明，14株沙门菌主要血清型是肠炎沙门菌(50%)和鸡白痢沙门菌(50%)；MLST结果表明，14株沙门菌分为三种ST型，分别是ST11、ST92和ST2151，其中ST92和ST2151为鸡白痢沙门菌，ST11为肠炎沙门菌，该结果与血清分型结果一致。一种ST型对应着一种血清型或者几种ST型对应着一种血清型，说明这两种方法可以对沙门菌进行准确分型，而两种方法的相互验证，可确保沙门菌分型准确结果。（4）本研究发现，禽沙门菌的分离鉴定可通过菌落形态观察与PCR方法结合等完成其准确鉴定；并发现其与血清分型、MLST分子分型结果完全一致。

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（2019–07–21）

国家十三五重点研发计划项目: 2016YFD0501608；山东农业重大应用技术创新项目(SD2019XM009)

S852.61+2

A

1007-1733(2019)08-0001-04