四氯化碳诱导近交系C57BL/6小鼠建立肝纤维化模型

刘甦苏 霍桂桃 王辰飞 范昌发

(1.中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所，北京 102629)(2.中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心，北京 100176)

肝纤维化是机体对各种病因引起的慢性肝损伤后的一种损伤修复反应，呈现高发病率、高死亡率特征。四氯化碳(carbon tetrachloride， CCl4)诱导肝脏纤维化是目前常用的造模方法，本法建立的肝纤维化模型已广泛用于研究肝纤维化的细胞及分子机制、血清学标志物、组织病理及抗纤维化物质的药效评价[1-2]。

目前国内多采用SD大鼠和封闭群小鼠进行CCl4急性肝毒性实验，选取的给药途径、剂量、时间间隔等因素也多有不同[3-6]。近交系小鼠具有遗传背景均一、对药物反应的一致性好、可重复性强等特点，被广泛用于生命科学、医学等研究中[7-8]。建立稳定可靠的肝纤维化模型可以为肝纤维化发病机制研究、抗肝纤维化药物的筛选及评价提供工具。因此，本研究选择常用C57BL/6小鼠品系，摸索最适造模剂量和方法方式，建立稳定、个体差异小的近交系C57BL/6小鼠的肝纤维化模型，为肝癌致病机理及临床医学研究工作提供稳定的疾病模型。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：近交系C57BL/6小鼠,由中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所繁殖，动物生产许可证号为SCXK(京)2017-0005。小鼠生产繁育在SPF级屏障设施内进行，动物实验在清洁级环境中进行，饲喂SPF级小鼠颗粒饲料，饮用灭菌自来水。

本实验在中国食品药品检定研究院实验动物伦理委员会监督下进行。

1.1.2主要仪器及试剂：本实验主要仪器设备有全自动生化分析仪(URIT-8260)，自动包埋机(日本樱花 TEC5EMJ-2型) 滑动式切片机(日本樱花 IVS-410 型)等； CCl4、橄榄油均购自国药集团化学试剂有限公司，AST、ALT 检测试剂均购自中生北控生物科技股份有限公司；其他常见生化试剂如乙醇、异戊醇、苯、氯仿购自北京化学工业集团有限公司。

1.2 方法

1.2.1肝纤维化模型分组及给药剂量：选取5周龄的C57BL/6近交系小鼠，每组5只。CCl4和橄榄油根据体积比混合，配置成20%(高剂量10 μL/g体质量)及10%(中剂量10 μL/g、低剂量5 μL/g)的CCl4溶液，对实验组小鼠进行每周2次腹腔注射，连续注射8周，对照组给予同体积橄榄油。

1.2.2观察指标

1.2.2.1 体质量及生存率观察

每周称量小鼠体质量，注射后注意观察一般情况并记录动物情况，例如精神状况和饮食量及小鼠体质量。

1.2.2.2 生化指标测定

各组小鼠分别在给药后1周、3周、6周、8周，通过眼球内眦静脉丛取血， 3 000 r/min离心10 min，分离血清后用全自动生化分析仪测定其ALT、 AST的水平。

1.2.2.3 肝脏组织病理学检查

连续给药8周后处死小鼠，先眼内眦采血，待小鼠死亡，解剖，取肝脏置于4%的甲醛固定, 切片厚度3～5 μm，石蜡包埋，苏木精一伊红(HE)染色，光镜下观察肝脏病理学改变。

1.3 统计方法

2 结果

2.1 近交系C57BL/6小鼠生存率的比较

为了获得近交系品系的肝纤维化模型，并验证给药剂量对成模率和生存率的影响，分别设置了高、中、低三个剂量组。给药24 h，小鼠存活率100%，未出现明显临床病理症状。高剂量组1周后，大量小鼠死亡，存活率仅为20%，而中、低剂量组，以及对照组小鼠均存活到8周实验结束，仅对照组有1只小鼠注射后第2天死亡，该鼠大体剖检显示XXX地方有损伤迹象，推测其与给药操作不当有关。从以上实验结果分析，CCl4给药剂量与小鼠模型生存率呈剂量效应，小鼠生存率结果(见图1)。

2.2 近交系小鼠肝纤维化形成过程中血清转氨酶水平的动态变化

本实验比较了各组各个时间点的ALT和AST含量，结果显示小鼠血清ALT和AST在给药后出现两头高、中间低的趋势，并未随造模时间的推进而逐渐升高，分析原因造模后一周的ALT和AST含量急剧升高，可能与药物急性毒性有关，随后8周时高、中、低剂量组的转氨酶水平升高，说明肝功能的损伤程度与注射浓度成正比，并在一定程度上反映肝纤维化的程度。ALT和AST升高，可能为肝细胞受损、微胆管梗阻所致。高剂量组指标与对照组相近，可能是存活的小鼠未造模成功。中、低剂量组的结果显示造模后8周，与对照组相比，小鼠血清中ALT和AST的水平升高明显，提示肝脏的合成功能受到了损害[9]。

图1 近交系C57BL/6小鼠各剂量组的生存率Fig.1 The survival rate of C57BL/6 mice in different each dosage group

图2 各剂量组近交系C57BL/6小鼠给药后 不同时间血清转氨酶水平注：纵坐标是各组小鼠血清ALT、AST的每L血清中水平，横坐标是给药时间；给药1周和8周，ALT、AST含量升高，与对照组相比差异极显著(**P<0.01)；3周和6周差异不明显(**P>0.01)，与对照组相比(**P<0.01)。Fig.2 The serum examination results of C57BL/6 mice in different times after administrationNote：The vertical coordinate is the level of ALT and AST in each group, and the horizontal coordinate is the time of administration. After 1 and 8 weeks of administration, ALT and AST content increased, indicates(**P<0.01) compared with the control group, while there was no significant difference between 3 weeks and 6 weeks (**P> 0.01), but indicates(**P<0.01) compared with the control group.

2.3 小鼠肝纤维化病理学改变

给予CCl48周后，高剂量组小鼠肝脏的主要病理学改变为极轻度肝细胞变性/坏死,极轻度中央静脉周围/汇管区混合细胞浸润；极轻度肝脏纤维化。中剂量组小鼠肝脏的主要病理学改变为极轻度至轻度肝细胞变性/坏死，轻度中央静脉周围/汇管区混合细胞浸润；极轻度肝脏纤维化。低剂量组小鼠肝脏的主要病理学改变为极轻度至轻度肝细胞变性/坏死；轻度至中度中央静脉周围/汇管区混合细胞浸润；极轻度至肝脏纤维化(见图3)。

图3 肝纤维化小鼠肝脏病理学改变(×200)注：A：对照组肝脏未见明显的病理学改变；B、C、D：高、中、低剂量组小鼠肝脏可见中央静脉/汇管区混合细胞浸润、肝细胞变性/坏死及纤维化。Fig.3 The liver pathology of fibrosis mice with HE stain(×200)Note: A: There were no obvious pathological changes in the liver of the control group; B, C, D: mixed inflammatory cell infiltrate, hepatocellular degeneration/necrosis and fibrosis in the central vein/portal area were observed in the liver of the high, medium and low dose groups.

实验结果发现，高剂量动物组动物死亡率为80%，剩余的一只动物镜检发现病变。低，中剂量组未出现动物死亡，但是镜检发现中剂量组的病变程度高于低剂量组，存在药物剂量效应。随着给药时间增长，肝脏的中央静脉周围/汇管区混合细胞浸润及肝脏纤维化程度加重。

3 讨论

肝纤维化动物模型的建立是研究肝纤维化发病机制的基础，本实验室尝试近交系C57BL/6小鼠作为研究对象，采用常用的诱导肝损伤模型的四氯化碳化学试剂通过给予小鼠高、中、低剂量，观察其对肝纤维化模型建立的影响，以探索建立小鼠肝纤维化模型的方法。结果显示，随CCl4浓度增高，高剂量组小鼠死亡率偏高，中、低剂量组小鼠8周后肝脏出现纤维化，中剂量组的肝组织病变程度高于低剂量组。

肝纤维化时常伴随肝功能损伤， 检测谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)指标和肝脏组织病理学诊断方可确定是否发生肝纤维化。因此本实验检测了AST、ALT等反映肝功能变化的指标。重复结果表明，给药8周后小鼠血清AST、ALT水平升高，且中剂量组的含量高于低剂量组，说明肝功能的损伤程度与注射浓度成正比，并在一定程度上反映肝纤维化的程度[10-11]。

综上所述，通过注射10%CCl4，10 μL/g，共8周能够明显地诱导小鼠肝纤维化形成，且死亡率较低，是一种较理想的制作肝纤维化模型的方法，这为研究肝纤维化的发病机制奠定了基础。