小麦蛋白双酶酶解制备高抗氧化性小麦肽研究

郑志强 郝利民 刘 晋 郭顺堂

（1 中国农业大学食品科学与营养工程学院 北京100083 2 军事科学院系统工程研究院军需工程技术研究所 北京100010）

小麦蛋白，俗称谷朊粉，其蛋白质含量高达75%～85%，主要由麦醇溶蛋白和麦谷蛋白组成[1]。麦醇溶蛋白为单体蛋白，呈球形，由脯氨酸和酰胺等非极性氨基酸组成，非极性侧链比极性侧链多，单肽链间依靠氢键、疏水键及分子内二硫键连接，分子无肽链间二硫键，形成紧密的三维结构；麦谷蛋白是一种非均质的大分子聚合体，呈纤维状，由17～20 种不同的多肽亚基组成，靠二硫键连接[1-2]。由于小麦蛋白独特的结构和氨基酸组成，如含有较多的疏水性氨基酸和不带电荷的氨基酸，导致分子内疏水作用区域较大，从而使其在水中的溶解性很差。为提高其加工及功能性能，研究者采取多种方法对其进行改性研究，如物理方法、化学方法和酶解法。蛋白质酶解改性反应过程温和、高效、易控、产物安全性高，使得酶解技术具有传统热处理、酸碱处理等改性方法无可比拟的优势，因此在小麦蛋白改性方面被广泛研究和应用。通过酶解改性，提高了小麦蛋白的溶解度，同时也提高了其功能特性。Drago 等[3]提出将小麦蛋白在14%水解度的条件下水解，水解后的溶解度提高了87%，而且溶解的pH 值范围更大。Bollecker 等[4]研究表明纯化的麦醇溶蛋白酶解后，因分子体积减小而显著提高了其溶解性。蛋白质酶解产物是多肽和游离氨基酸的混合物，其中含有大量小分子质量的多肽，小分子质量多肽吸收与氨基酸吸收相比具有转运速度快，耗能低，可避免氨基酸之间的吸收竞争，载体不易饱和等特点，因此更容易被机体吸收利用，并具备一些特殊的生理功能[5-6]。

小麦肽是小麦蛋白酶解的主要产物，其功能特性受到学者的广泛研究，如抗氧化[7-11]、降血压[12-15]、阿片活性[16-19]、抑癌活性[20-21]等。抗氧化性是小麦肽的主要功能特性，小麦肽含有的抗氧化功效成分可以有效清除体内产生的自由基，使机体免受自由基引起的损伤。清除自由基能力是小麦肽在体内或体外体现抗氧化功能的主要指标。酶解程度的控制直接决定了具有抗氧化活性肽段生成的多少。酶解过程中用酶的选择以及酶解的工艺参数对小麦肽的抗氧化活性高、低起着重要作用。本课题组前期对制备高抗氧化活性小麦肽的用酶进行了筛选[22]，结果显示碱性蛋白酶和风味蛋白酶效果较好。本试验选择碱性蛋白酶、风味蛋白酶为小麦蛋白的酶解用酶，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 自由基清除率、超氧阴离子自由基（O2－·）清除率、羟自由基（·OH） 清除率等为反映抗氧化能力的主要指标，采用分步酶解方式，对两种酶的最佳酶解工艺参数进行优化，并对最终酶解物进行超滤分级分离，确定制备高抗氧化性小麦肽的最优工艺参数以及具有最强抗氧化能力小麦肽的分子质量范围，为高抗氧化性小麦肽的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小麦蛋白（蛋白质含量82%），商丘华阳生态农业发展有限公司。

碱性蛋白酶 （217 434 U/mL）、风味蛋白酶（30 916 U/mL），诺维信（中国）生物技术有限公司；其它试剂均为国产分析纯级。

1.2 仪器与设备

P-2102UV 型紫外分光光度计，上海新嘉电子有限公司；PHS-3C 型pH 计，上海理达仪器厂；BW3200S 型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；LGJ-10 真空冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司；SHZ-B 水浴恒温振荡器，上海五相仪器仪表有限公司；CR22G 高速冷冻离心机，日本日立公司；LNG-UF-101 超滤设备，上海朗极化工科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 双酶分步酶解工艺 小麦蛋白100 g→加一定量（按试验要求计算所得）去离子水混合→在设定温度（碱性蛋白酶最适温度55 ℃）的水浴锅中保温→用1.0 mol/L NaOH 或HCl 调节溶液的pH 值于设定条件（碱性蛋白酶最适pH 值8.5）→加入一定量（按试验要求计算所得）酶开始酶解→酶解过程中每20 min 用1.0 mol/L NaOH 或HCl调节溶液pH 值保持不变→搅拌酶解→酶解结束后沸水灭酶10 min →调节温度和pH 值至风味蛋白酶最适宜条件（温度50 ℃、pH 6.5）→加入一定量（按试验要求计算所得）风味蛋白酶开始第2步酶解→酶解过程中每20 min 用1.0 mol/L NaOH 或HCl 调节溶液pH 值保持不变→搅拌酶解→酶解结束后沸水灭酶10 min→冷却后3 000 r/min 离心20 min→取上清液冷冻干燥→-20 ℃保存待用。

1.3.2 自由基清除率测定 按照双酶分步酶解工艺，采用试验设计的不同酶解参数对小麦蛋白进行酶解，得到相应的酶解物，并对酶解物的DPPH自由基清除率、O2－·清除率、·OH 清除率等分别测定，DPPH 自由基清除率测定参照LI 等[23]方法，O2－·清除率测定参照LI[24]方法，·OH 清除率测定参照HALLIWELL 等[25]方法。酶解物质量浓度为3 mg/mL 时测定自由基清除率。

1.3.3 单因素试验 不同蛋白酶均有其最适宜的反应温度和pH 值，碱性蛋白酶最适温度为55℃、最适pH 值8.5，风味蛋白酶最适温度50 ℃、最适pH 值6.5。本试验设定两种酶在其对应的最适宜温度和pH 值条件下进行酶解反应。

1.3.3.1 碱性蛋白酶酶解单因素试验 对碱性蛋白酶最适温度55 ℃、最适pH 值8.5 固定不变，每次试验改变底物浓度、酶浓度、反应时间中的一个因素。在底物质量分数（%）设定为4，6，8，10，12，14，16 共7 个水平值进行单因素试验时，酶含量设定为2 000 U/g，反应时间设定为4 h；在酶含量（U/g）设定为500，1 000，1 500，2 000，2 500，3 000，3 500 共7 个水平值进行单因素试验时，反应时间设定为4 h；在反应时间（h）设定为1，2，3，4，5，6，7 共7 个水平值进行单因素试验。

1.3.3.2 风味蛋白酶酶解单因素试验 采用优化的碱性蛋白酶酶解参数进行第1 步酶解的基础上，开展风味蛋白酶第2 步酶解，对风味蛋白酶最适温度50 ℃、最适pH 值6.5 固定不变，每次试验改变酶浓度和反应时间中的一个因素。在酶含量（U/g）设定为500，1 000，1 500，2 000，2 500，3 000，3 500 共7 个水平值进行单因素试验时，反应时间设定为4 h；在反应时间（h）设定为1，2，3，4，5，6，7 共7 个水平值进行单因素试验。

1.3.4 响应面试验设计

1.3.4.1 碱性蛋白酶酶解响应面试验设计 在单因素试验的基础上，选择影响自由基清除效果的主要因素底物浓度X1、酶浓度X2、反应时间X3共3 个因素为自变量，DPPH 自由基清除率Y1、O2－·清除率Y2、·OH 清除率Y3为因变量，采用统计分析软件Design-Expert V8.0.6 版中Box-Behnken 进行响应面优化试验，设计3 因素3 水平的试验，并以-1、0、1 分别代表响应因素的低、中、高水平，各因素水平及编码见表1。

1.3.4.2 风味蛋白酶酶解响应面试验设计 在单因素试验的基础上，选择影响自由基清除效果的主要因素酶浓度X1、反应时间X22 个因素为自变量，DPPH 自由基清除率Y1、O2－·清除率Y2、·OH 清除率Y3为因变量，采用统计分析软件Design-Expert V8.0.6 版中Central Composite 进行响应面优化试验，设计2 因素3 水平试验，各因素水平及编码见表2。

表1 Box-Behnken 试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken experimental design

表2 中心组合试验设计因素与水平Table 2 Factors and levels used in Central Composite experimental design

1.3.5 超滤分级分离 选择碱性蛋白酶和风味蛋白酶在最优酶解工艺参数条件下酶解小麦蛋白制得小麦混合肽样品，该样品主要由不同分子质量的多肽及少量游离氨基酸组成。采用截留分子质量分别为5 000，3 000，1 000 u 的超滤膜对小麦混合肽样品进行分级分离，获得Ⅰ组分（分子质量大于5 000 u）、Ⅱ组分（分子质量3 000～5 000 u）、Ⅲ组分（分子质量1 000～3 000 u）、Ⅳ组分（分子质量小于1 000 u），所有组分冷冻干燥备用。对Ⅰ～Ⅳ组分以及小麦混合肽样品（命名为Ⅴ组分）配制质量浓度为3 mg/mL 的溶液，对其进行DPPH 自由基清除率、O2－·清除率、·OH 清除率的测定。

2 结果与分析

2.1 碱性蛋白酶酶解单因素试验结果

2.1.1 底物质量分数对自由基清除率的影响 由图1可知，底物质量分数小于10%时，随着底物质量分数的增大，小麦蛋白酶解物的3 种自由基清除能力均有增强的趋势；底物质量分数为10%时，DPPH 自由基、O2－·和·OH 清除能力均达到最大值，分别为56.31%，55.67%和58.46%；当底物质量分数大于10%时，3 种自由基的清除能力均有一定程度的下降。在酶浓度一定的条件下，底物浓度的大小决定了小麦蛋白酶解物生成量的多少，而酶解物的量对自由基的清除有重要影响，当有足够的酶与底物发生反应时，底物浓度越大生成的酶解小分子物质越多，这时酶解物具有很强的自由基清除能力；当加入的酶与底物反应完全后，再增大底物浓度使底物处于过饱和状态，在一定程度上抑制了底物与酶的结合反应。此外，小麦蛋白的溶解性很差，底物浓度太大不利于小麦蛋白的分散，甚至导致小麦蛋白结团，这不利于小麦蛋白的酶解反应。选择底物质量分数为10%时，小麦蛋白酶解物的自由基清除能力最佳。

2.1.2 酶浓度对自由基清除率的影响 由图2可知，酶含量小于2 000 U/g 时，小麦蛋白酶解物的3种自由基清除能力随着酶浓度的增大均有增强；酶含量为2 000 U/g 时，3 种自由基清除能力均达到最大；酶含量大于2 000 U/g 时，3 种自由基的清除能力均，平缓下降。底物浓度一定时，加酶量的多少决定了小麦蛋白酶解反应后生成多肽的量，当足够的酶与所有底物完全反应后，这时酶解物生成量最大，清除自由基能力也最强，酶解物浓度与清除自由基能力呈明显的正相关[26]。当酶超量时，过量的酶对小麦蛋白酶解更彻底，可生成大量的氨基酸，而氨基酸过多不利于自由基的清除。同时，酶添加过多可导致酶之间的竞争，对小麦蛋白酶解反应有一定抑制作用。此外，酶的成本也较高。选用适量的酶是蛋白水解的重要环节。本试验结果显示：当酶含量为2 000 U/g 时，小麦蛋白酶解物清除自由基能力最好。

图1 不同底物含量对DPPH 自由基、O2－·和·OH清除率的影响Fig.1 Effect of different substrate concentrations on scavenging activities of DPPH radical，O2－·and ·OH

图2 不同酶含量对DPPH 自由基、O2－·和·OH清除率的影响Fig.2 Effect of different enzyme concentrations on scavenging activities of DPPH radical，O2－·and ·OH

2.1.3 反应时间对自由基清除能力的影响 由图3可知，随着酶解时间的延长，小麦蛋白酶解物的3 种自由基清除能力均有增强趋势，酶解4 h 时自由基清除能力达到最大，酶解4 h 后自由基的清除能力趋于稳定并略有下降。小麦蛋白与酶的结合反应需要时间，4 h 内反应迅速，蛋白与酶充分结合，生成大量的小麦多肽，这有利于自由基清除效果的快速提升；4 h 时小麦蛋白与酶反应基本结束，小麦多肽的生成量基本固定，3 种自由基清除能力达到最大值。4 h 后小麦多肽的量不再显著增加，自由基清除能力变化不大。小麦多肽与空气接触时间过长可被空气氧化，使其自由基清除能力有所下降。此外，酶解时间过长也不利于控制生产成本。选择小麦蛋白最佳酶解时间为4 h。

图3 不同反应时间对DPPH 自由基、O2－·和·OH清除率的影响Fig.3 Effect of different reaction time on scavenging activities of DPPH radical，O2－·and ·OH

2.2 碱性蛋白酶酶解响应面试验结果

对试验数据进行回归拟合，得到响应面回归方程：

对方程中各项以及交互项进行方差分析，结果见表4。

表3 Box-Behnken 试验设计及结果Table 3 Andexperimental results of Box-Behnken experimental design

表4 回归方程方差分析Table 4 Variance analysis of regression equation

由表4方差分析可知，试验各指标所建立的二次回归模型均极显著（P＜0.01），各响应值的失拟项分别为0.4360，0.1439，0.1826，均大于0.05，不显著，说明该模型与实际数据拟合良好，回归方程不失拟，可用该回归方程对试验结果进行分析。回归系数R2分别为0.9568，0.9435，0.9678，说明响应值结果与模型预测结果具有良好的一致性；校正系数RAdj2分别为0.9013，0.8708，0.9264，说明该模型能解释90.13%，87.08%，92.64%的响应值变化。变异系数CV 值表示试验本身的精确度，CV值越小，精确度越高，本试验各响应值的CV 值分别为4.07%，4.85%，3.78%，CV 值较低，试验的可靠性较高。该模型可用于分析和预测碱性蛋白酶第1 步酶解小麦蛋白制备强自由基清除能力小麦肽的工艺，用该模型可较好地优化试验方案。

由各因素的显著性分析可知，一次项底物浓度、酶浓度、反应时间对3 种自由基清除率均有极显著影响（P＜0.01），交互项底物浓度与酶浓度对3种自由基清除率均有显著或极显著影响 （P＜0.05或0.01），二次项底物浓度、酶浓度、反应时间对3种自由基清除率均有显著或极显著影响 （P＜0.05或0.01）。由回归方程的一次项系数绝对值可以看出，酶浓度对3 种自由基清除率的影响最大。底物浓度与酶浓度的交互作用对3 种自由基清除率影响的响应面及等高线图见图4。

图4 底物浓度与酶浓度交互作用对自由基清除率影响的响应面及等高线图Fig.4 Response surface plots and corresponding contour plots for interactive effect of substrate concentration and enzyme concentration on free radical-scavenging activities

通过Box-Behnken 试验回归模型得到各响应面和等高线图，图中椭圆排列越紧密，因素变化对结果影响越大；响应面坡度越陡，响应值对工艺参数的变化越敏感，该参数对试验结果的影响越大；等高线的形状可反映交互作用的强弱，椭圆表示两因素交互作用显著，圆形则相反[27]。由图4可知，3 种自由基清除率对应的响应面图和等高线图的变化趋势类似，底物浓度与酶浓度二者间的交互作用对3 种自由基清除率均有显著影响。当酶浓度固定不变时，随着底物浓度的增加，3 种自由基清除率呈现先上升后下降趋势，下降趋势不明显，酶浓度越高，3 种自由基清除率随底物浓度的增加而增长越快；当底物浓度固定不变时，随着酶浓度的增加，3 种自由基清除率快速上升，上升至一定程度后下降，底物浓度越高，3 种自由基清除率随酶浓度的增加而增长越快。由等高线图可看出，底物质量分数在11%～12%，酶含量在2 000～2 300 U/g 范围，3 种自由基清除率可优化出最大值。

采用Design-Expert V8.0.6 分析软件对回归方程进行模拟优化，得出碱性蛋白酶第1 步酶解最佳酶解工艺参数为：底物质量分数11.20%、酶含量2 220.09 U/g、反应时间4.32 h，这时预测的DPPH 自由基清除率为60.25%，O2－·清除率为58.86%，·OH 清除率为61.05%。

2.3 碱性蛋白酶酶解最佳工艺参数验证结果

图5 不同酶含量对DPPH 自由基、O2－·和·OH清除率的影响Fig.5 Effect of different enzyme concentrations on scavenging activities of DPPH radical，O2－·and ·OH

为进一步验证模型的可靠性，便于实际生产操作，将碱性蛋白酶第1 步酶解最佳工艺参数调整为底物质量分数11.2%，酶含量2 200 U/g、反应时间4.3 h，反应pH 值8.5，反应温度55 ℃，在此工艺参数条件下，实测DPPH 自由基清除率为59.88%，O2－·清除率为58.12%，·OH 清除率为60.53%。实际值与模型预测值较为接近，说明该回归方程建立的模型与实际情况拟合较好，优化酶解工艺参数较可靠。

2.4 风味蛋白酶酶解单因素试验结果

采用碱性蛋白酶按上一步优化好的最佳酶解工艺参数酶解小麦蛋白，酶解结束后迅速高温灭酶；调节温度和pH 值至风味蛋白酶最适宜条件：温度50 ℃、pH 值6.5；添加风味蛋白酶进行第2步酶解。

2.4.1 酶浓度对自由基清除率的影响 由图5可知，风味蛋白酶添加量为1 000 U/g 时，小麦蛋白酶解物的3 种自由基清除能力均达到最大值，当酶含量大于1 000 U/g 时，3 种自由基的清除能力均呈下降趋势。第2 步酶解过程中，酶浓度越大，对小麦蛋白的酶解越彻底，大量肽链断裂为游离氨基酸，由多肽变为氨基酸，对自由基清除能力的影响很大，虽然部分氨基酸如His、Tyr、Met 等具有清除自由基的功能[28-29]，但在小麦蛋白酶解物中，分子质量较小的多肽对清除自由基功能仍起主要作用。例如WANG 等[10]研究发现小麦蛋白酶解物中分子质量小于5 000 u 的多肽在中性条件下具有与维生素E 几乎相同的抗氧化能力，其中分子质量为4 200 u 的多肽占86.5%，并具有较高的抗氧化活性。从提高自由基清除角度出发，分子质量较小的多肽生成量越多，对自由基清除越有利。本试验研究确定第2 步酶解中风味蛋白酶的添加量为1 000 U/g 对自由基清除效果最佳，这时测得DPPH 自由基清除率为71.24%，O2-·清除率为68.31%，·OH 清除率为72.06%。

图6 不同反应时间对DPPH 自由基、O2－·和·OH清除率的影响Fig.6 Effect of different reaction time on scavenging activities of DPPH radical，O2－·and ·OH

2.4.2 反应时间对自由基清除率的影响 由图6可知，第2 步酶解时间为2 h 时，小麦蛋白酶解物的3 种自由基清除能力均达到最大值；酶解时间2～4 h 时，3 种自由基的清除能力均呈基本稳定状态，下降不明显；酶解时间大于4 h 后，3 种自由基的清除能力均呈明显下降趋势。第2 步酶解过程中，酶解时间大于2 h，自由基清除能力随着酶解时间的延长下降越来越快，这是由于随着酶解时间的延长，小麦蛋白酶解彻底，酶解生成的具有清除自由基能力的小麦肽进一步水解而减弱其清除自由基能力。第2 步风味蛋白酶酶解适宜时间为2 h，这时测得DPPH 自由基清除率为76.59%，O2-·清除率为74.1%，·OH 清除率为77.85%。

2.5 风味蛋白酶酶解响应面试验结果

对试验数据进行回归拟合，得到响应面回归方程：

对方程中各项进行方差分析，结果见表6。

表5 中心组合试验设计及结果Table 5 Central Composite experimental design and experimental results

表6 回归方程方差分析Table 6 Variance analysis of regression equation

由表6方差分析可知，通过各指标建立的二次回归模型均极显著（P＜0.01），各响应值的失拟项均大于0.05，不显著，说明该模型与实际数据拟合良好，回归方程不失拟，可用该回归方程对试验结果进行分析。回归系数R2分别为0.9404，0.9673，0.9602，说明响应值结果与模型预测结果具有良好的一致性；校正系数RAdj2分别为0.8979，0.9439，0.9317，说明该模型能分别解释89.79%，94.39%，93.17%的响应值的变化。本试验各响应值的变异系数CV 值分别为3.2%，1.97%，2.5%，CV 值较低，说明试验的可靠性较高。该模型可用于分析和预测风味蛋白酶第2 步酶解小麦蛋白，制备强自由基清除能力小麦肽的工艺，用该模型可较好地优化试验方案。由各因素的显著性分析可知，一次项酶浓度、反应时间对3 种自由基清除率均有显著影响（P＜0.05），交互项酶浓度与反应时间对3 种自由基清除率均无显著影响，二次项酶浓度、反应时间对3 种自由基清除率均有极显著影响（P＜0.01）。

采用Design-Expert V8.0.6 分析软件对回归方程进行模拟优化，得出风味蛋白酶第2 步酶解最佳酶解工艺参数为：酶含量1 072.73 U/g、反应时间2.17 h，这时预测的DPPH 自由基清除率为76.12%，O2-·清除率为75.38%，·OH 清除率为76.94%。

2.6 风味蛋白酶酶解最佳工艺参数验证结果

为进一步验证模型的可靠性，便于实际生产操作，将风味蛋白酶第2 步酶解最佳工艺参数调整为酶含量1 070 U/g，反应时间2.2 h，反应pH 值6.5，反应温度50 ℃，在此工艺参数条件下，实测DPPH 自由基清除率为75.36%，O2-·清除率为74.51%，·OH 清除率为76.29%。实际值与模型预测值较为接近，说明由该回归方程建立的模型与实际情况拟合较好，优化酶解工艺参数较可靠。

2.7 不同分子质量小麦肽组分对自由基清除率的影响

图7 不同分子质量小麦肽组分对自由基清除率的影响Fig.7 Effect of wheat peptides with different molecular weight on radical scavenging activities

由图7可知，小麦肽分子质量不同，对3 种自由基清除率均有一定影响，分子质量越小，自由基清除效果越好，其中分子质量小于1 000 u 的组分3 种自由基清除率最高（P＜0.05），其次是小麦混合肽样品，二者自由基清除效果接近，说明小麦混合肽样品中的主要组分是分子质量小于1 000 u 的小肽。酶解物中小分子质量的多肽所占比例越大，代表其水解程度越高，对应的抗氧化能力也越强。大量研究[8，11，30]表明，小分子质量小麦肽相较大分子质量的小麦肽具有更高的抗氧化活性。本试验制备的小麦肽样品具有较高的自由基清除能力，说明小麦蛋白双酶酶解效果较好，有利于赋予小麦肽较高的抗氧化活性。

3 结论

采用碱性蛋白酶和风味蛋白酶双酶分步酶解方式酶解小麦蛋白制备高抗氧化性小麦肽，得到双酶酶解的最优工艺参数：第1 步碱性蛋白酶底物质量分数11.2%、酶含量2 200 U/g、pH 值8.5、温度55 ℃、酶解时间4.3 h；第2 步风味蛋白酶酶含量1 070 U/g、pH 值6.5、温度50 ℃、酶解时间2.2 h。最终酶解物DPPH 自由基清除率为75.36%，O2-·清除率为74.51%，·OH 清除率为76.29%，其中分子质量小于1 000 u 组分自由基清除率最高。