肉桂精油微胶囊中精油提取和测定方法的比较

李 霞 范亚苇 张 兵 寇秀颖 从仁怀 邓泽元*

（1 南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室 南昌330047 2 无限极（中国）有限公司 广州510623）

肉桂为樟科植物肉桂的干燥树皮。肉桂油是将肉桂的干燥枝、叶进行水蒸气蒸馏得到的挥发油，有肉桂的特异香气，为黄色或黄棕色的澄清液体，味甜、辛辣，置空气中或存放日久，色渐变深，质渐浓稠[1]。肉桂精油成分比较复杂，主要活性成分包括肉桂醛（约75%～90%）[2-3]。另外，含有苯甲醛、香草醛、乙酸桂酯、香豆素、丁香酚、2 一甲氧基桂酸和二氢桂酸等成分[4]，具有镇痛解痉[5]，抗血小板聚集[6]，抗菌消炎[7-9]，抗肿瘤[10]，降血糖血脂[11-12]，增强肠胃蠕动[13]等多方面作用。由于肉桂精油具有较强的挥发性，遇光和热不稳定，在空气中易被氧化，因此在一定程度上限制了它的应用，而将其微胶囊包埋可明显地降低其挥发性，增强稳定性[14-15]。

在精油微胶囊的制备中，包埋效率是评价微胶囊包埋效果的一个重要指标，简称包埋率[16]。包埋率是指微胶囊中被包埋的精油与微胶囊总精油的质量分数或体积分数[17]。包埋率越高，精油被包埋的量越大，效果越好。在制备精油微胶囊时，由于精油的挥发，微胶囊所含的精油与投入精油的量是不一样的。在计算包埋率时，关键是准确提取微胶囊中所含的总精油和表面精油，从而计算微胶囊中被包埋率。

微胶囊表面油的提取主要使用石油醚或乙醚浸提[18]。基于肉桂精油难溶于石油醚，易溶于乙醚的物理性质，采用乙醚浸提的方法进行微胶囊表面油的提取、测定。因总精油含量的测定直接影响包埋率的计算，故准确提取测定微胶囊总精油的含量对评价微胶囊效果至关重要。微胶囊中总精油的提取方法较多，目前没有统一的标准。李荣等[19]分别采用无水乙醇、乙醚超声萃取后，以重量法测定微胶囊中肉桂精油。陈燕等[20]按药典中挥发油的测定方法，用水蒸气蒸馏法提取微胶囊中的薄荷精油。彭颖等[21]使用乙醇超声提取微胶囊中的肉桂精油后用标准曲线进行定量。岳淑丽等[22]用干燥失重法测定微胶囊中桉叶精油，Shaikh J 等[23]采用热重分析法测定微胶囊中黑椒树脂，王赛赛等[24]分别采用碱性-乙醚法 （罗紫－哥特里法）、混合有机溶剂[25]萃取微胶囊中的精油。目前这些精油的提取、测定方法没有进行结果比较。热重分析法因测试费用昂贵，应用较少。其它测试方法应用均较多。精油定量的方法一般采用重量法[26]及 标 准 曲 线 法[19]。

本研究选取干燥失重法、挥发油测定法（蒸馏法）、紫外分光光度法（乙醇超声-标准曲线法）和混合溶剂提取称重法对微胶囊精油进行提取并对比分析，旨在为肉桂精油微胶囊总精油含量的测定提供科学依据，以期获得微胶囊中精油提取率高，稳定性好且简单方便的提取、测定方法。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

材料与试剂：肉桂精油 （肉桂醛含量85%～95%，批号20160301），江西汇通药用香料油有限公司；大豆分离蛋白（食品级，90%），古神生物科技有限公司；变性淀粉（食品级），德清三富食品有限公司；麦芽糊精（食品级，SE：5-20），山东西王淀粉有限公司；石油醚（30～60 ℃）、乙醇、乙醚等常用有机试剂均为国产分析纯级。

1.2 主要仪器与设备

FA22 型电子分析天平，上海舜宇恒平科学有限公司；L6S 紫外-可见分光光度计，上海仪点分析仪器有限公司；50LA 型胶体磨，上海东华高压均质机厂；60-6S 型均质机，上海东华高压均质机厂；MDR-50 150 型喷雾塔，锡山市现代喷雾干燥机；HJ-3 型数显恒温磁力搅拌器，常州国华电器有限公司；HH-S11 型恒温水浴锅，太仓科教器材厂；OZF-6050 型真空干燥箱，上海新苗医疗机械制造有限公司；超声波清洗机（25HZ，300W），无锡市上佳生物科技有限公司；BT100-2J 精密蠕动泵，保定兰格恒流泵有限公司等。

1.3 方法

1.3.1 肉桂精油微胶囊样品的制备 采用万婷婷等[27]方法进行改进，采用喷雾干燥法制备肉桂精油微胶囊。称取126.0 g 混合壁材（壁材各组分质量比：变性淀粉∶麦芽糊精∶大豆分离蛋白=1 ∶9 ∶4，54.0 g 肉桂精油，使芯壁比为3 ∶7。用750 mL 去离子水55 ℃搅拌溶解形成溶液，30 min 后，将精油匀速缓慢加入壁材水溶液中，55 ℃搅拌1 h，经胶体磨分散后高压均质得到乳化液，用蠕动泵进入离心喷雾塔，形成微胶囊颗粒，以备后续试验使用。

1.3.2 微胶囊总精油含量的提取、测定

1.3.2.1 干燥失重法 准确称取5.0 g 干燥的肉桂精油微胶囊，其质量记为m1，置于干燥的锥形瓶中，加入50 mL 无水乙醇，加盖密封，在超声波清洗机中60 ℃震荡超声40 min，真空抽滤，用无水乙醇充分洗涤滤渣，将滤渣并滤纸在50 ℃真空干燥箱中干燥至恒重，记其质量为m2，同等规格滤纸恒重m3，则肉桂精油微胶囊总油质量为m1-m2-m3。

1.3.2.2 挥发油测定方法 参考2010 版《中国药典》附录XD 挥发油测定法（甲法）[1]。由于微胶囊中的精油含量与新鲜枝叶中精油含量相差太大，所以用于蒸馏的微胶囊粉末样品少。此时刻度的读数误差带来的结果误差较大，不可忽视。对肉桂精油微胶囊精油提取采用改进的同时蒸馏方法，在肉桂精油随水蒸气蒸馏的同时用二氯甲烷进行有机萃取，真空旋干溶剂后称重，以便减小读数的误差。

具体方法：精密称取5.0 g 肉桂精油微胶囊置于装有10 粒玻璃珠的500 mL 圆底烧瓶中，并加入300 mL 去离子水，有机相烧瓶（m1）加入60 mL二氯甲烷，连接同时蒸馏装置和回流冷凝管。用调温电热器加热至两相同时沸腾，并保持微沸约3 h后停止加热，将二氯甲烷的有机相收集后50 ℃真空旋干后称重（m2），则肉桂精油微胶囊总油质量为（m2-m1）。

1.3.2.3 紫外分光光度法

1） 最大吸收波长的测定 用移液管量取0.1 mL 肉桂油标准品滴入10 mL 比色管中，用无水乙醇定容10 mL，再用滴管取定容液0.1 mL 滴入10 mL 比色管，用无水乙醇定容10 mL 作为储备液。用无水乙醇稀释若干倍后作为肉桂精油工作液。以无水乙醇为空白，对工作液在波长200～400 nm范围进行扫描，间隔1 nm，从扫描图谱中确定最大吸收波长。

2） 标准曲线的绘制 分别取肉桂精油工作液0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL，用无水乙醇定容10 mL，在前面获得的最大吸收波长处测吸光度值，然后通过吸收强度对肉桂精油浓度作图，即得到肉桂精油对吸光度的标准工作曲线。

3） 总油的测定 精密称取5.0 g 肉桂精油微胶囊，溶于50 mL 无水乙醇中，在超声波清洗机中60 ℃超声震荡40 min。将溶液在高速离心机上离心20 min，倾出上清液，加入50 mL 乙醇超声萃取，重复萃取操作至上清液无明显精油气味，合并，准确计量上清液体积。取1 mL 上清液，配制桂精油-无水乙醇溶液，以无水乙醇为空白组，在波长286 nm 处测量所配溶液的吸光值。根据回归方程计算肉桂精油-乙醇溶液中肉桂精油的体积分数，再乘以上清液的体积，通过密度（ρ=1.060 g/cm3）即可计算肉桂精油微胶囊中总油的质量。

1.3.2.4 混合溶剂提取称重法 在冯伟等[28]研究的基础上进行改进。称取2.0 g 微胶囊粉末，用10 mL 温水溶解，加入15 mL 无水乙醇。摇匀后加入25 mL 乙醚，充分振摇1 min，加入10 mL 沸程为30～60 ℃的石油醚，加塞水平振摇1 min，静置分层，将有机相转移至已知质量的烧瓶（m1）。在水相中继续加入5 mL 无水乙醇，15 mL 乙醚，5 mL 石油醚，采用上述方法操作，第3 次仅加入15 mL 乙醚。提取完毕后合并有机相，50 ℃减压浓缩至溶剂挥干后称重（m2），则肉桂精油微胶囊总油质量为m2-m1。

1.3.3 微胶囊精油含量的计算

1.4 4 种方法精密度和准确度的测定

1.4.1 精密度试验 精密度指测定同一匀质样品的一组测量值彼此符合的程度，它们越接近就越精密。常用相对标准偏差（RSD）来表示分析测试结果的精密度，RSD 越小，误差越小，精密度越好。

1） 仪器精密度试验 干燥失重法中的滤渣、挥发油提取及混合溶剂提取的精油或紫外分光光度法配制的精油溶液，连续6 次称重或测定吸光值，计算各方法精油含量的相对标准偏差（RSD），考察仪器的精密度。

2） 样品稳定性试验 将干燥失重法中的滤渣、挥发油提取及混合溶剂提取的精油或紫外分光光度法配制的精油溶液，分别在0，2，4，8，12，24 h 称重或测定吸光值，计算各方法精油含量的相对标准偏差（RSD），考察样品及仪器的稳定性。

3） 方法重复性试验 取同一肉桂精油微胶囊粉末，按上述4 种方法提取并测定精油含量，重复6 次。计算4 种方法测得精油含量的相对标准偏差（RSD），考察方法的重复性。

1.4.2 准确度试验 准确度指测定的结果与真实值之间接近的程度。由于精油的投入量为定值，在试验过程中精油的挥发不确定，所以以测定值与投入量之比为精油的回收率为指标，回收率越高，准确度越高。

采用精油含量逐步增加法，制备含25%，30%，35%和40%的肉桂精油的微胶囊。采用前述4 种方法中准确度最高的方法测试不同精油投入量微胶囊的精油回收率，进行准确度试验的验证，重复6 次。

1.5 数据分析及计算

试验数据采用spss16.0 统计学软件进行ANOVA 因 素 分 析，用ANOVA 中 的Tukey 和Duncan 来比较组间数据的显著性差异。当P＜0.05时表示存在显著性差异，P＜0.01 时存在极显著性差异。

2 结果分析与讨论

2.1 肉桂精油紫外分光光度法标准曲线的建立

将肉桂精油乙醇溶液经波长200～400 nm 扫描，结果见图1。图谱显示在286 nm 处肉桂精油乙醇溶液有最大吸收峰，因此确定286 nm 为肉桂精油在紫外区的最大吸收波长。

以肉桂精油乙醇溶液中肉桂精油的体积分数为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，见图2。用强吸光值对肉桂精油的体积分数做回归处理，得肉桂精油乙醇溶液标准曲线的回归方程：y=0.0163x-0.0308，其中y 是溶液在波长286 nm 处的吸光值，x 是每毫升标准溶液中肉桂精油的体积。R=0.9994，在20～60 nL/mL 标准溶液中有良好的线性关系。

2.2 4 种方法对肉桂精油微胶囊测定方法的比较

乳液中投入的芯壁比为3∶7，即理论上精油的投入量为30%，4 种测试方法的结果见表1，表2。

图1 肉桂精油-乙醇溶液扫描谱图Fig.1 Absorption spectra of cinnamon essential oil-ethanol solution

图2 肉桂精油-乙醇溶液标准曲线Fig.2 Standard curve for cinnamon essential oil-ethanol solution

表1 4 种方法的精密度比较Table 1 Result of precision experiment

表2 4 种方法的准确度比较Table 2 Result of accuracy experiment

表3 混合溶剂法-精油回收率试验Table 3 Result of recovery experiment

4 种方法的仪器精密度的RSD 值均不超过2%，表明测量仪器具有良好的精密度。紫外分光光度法稳定性的RSD 值虽小于5%，但对于同一批样品的测定结果明显高于其它3 种方法。原因可能是测定时，精油在乙醇溶液中，因乙醇的挥发而加快其自身的挥发，或者也有可能是紫外检测器的氘灯长时间开启，灯能量的消耗而使得仪器的不稳定。比较4 种方法所得肉桂精油微胶囊总精油含量，挥发油测定法和紫外分光光度法为60%～70%，干燥失重法和混合溶剂提取法的精油回收率在80%以上（见表2）。根据《中国药典》要求，回收率为80%～120%之间可接受。干燥失重法的测定结果显示试验误差最大，重复性差，而混合溶剂提取法试验误差最小，重复性最好，且对不同含油量的微胶囊，精油的回收率均在80%以上（见表3），准确度较高。

干燥失重法在抽滤过程中有一定的微胶囊粉末通过滤纸进入滤液中，造成滤渣的损失，进而使干燥后差值变大，测定的总精油含量比实际的偏大。用乙醇超声破乳，不能完全将精油提取出来，使得结果偏小，此干燥失重法试验误差大，重复性差。挥发油的测定方法在《中国药典》标准方法的基础上做了改进，使用同时蒸馏装置，避免了长时间静置让油水分离，减少小体积精油量在读数上的误差。总体上时间较长，挥发油随水蒸气挥发的过程存在动态平衡，长时间蒸馏仍不能使精油完全挥发出来，而且长时间高温蒸馏，易使精油氧化。粘在蒸馏瓶壁上的微胶囊中没有完全破乳，精油可能没有完全蒸馏出来，导致对精油含量的测定也有影响。紫外分光光度法前处理复杂，配制标准曲线及稀释待测溶液需稀释上万倍以上，操作步骤繁琐，在震荡，离心，配制溶液等诸多环节均易产生人为操作误差，还受紫外分光光度计稳定性的影响，且需耗费大量无水乙醇，成本较高，然而紫外分光光度法检测速度较快。混合溶剂提取称重法是在罗紫-哥特里法（碱性乙醚法）的基础上进行了改进，仅用热水与乙醇破坏壁材，防止精油在强碱溶液中不稳定而导致变质的现象，并且调整有机溶剂的加入比例，减少因高比例的石油醚使得精油在有机相的溶解度降低的现象。在提取过程中不能过于剧烈摇晃，否则容易发生乳化现象，旋干后也经常需要二次萃取，需仔细操作。溶剂提取精油较完全，提取后的水相基本无精油风味，时间短，重复性高。

3 结论

紫外分光光度法和挥发油测定法结果偏低。紫外分光光度法操作复杂，测试结果受诸多因素的影响，对操作者及仪器的要求均较高，需耗费较多乙醇，相对成本较高。挥发油测定法操作简便、成本低，耗时较长。干燥失重法由于滤渣的损失，试验误差较大，测定结果偏高。混合溶剂提取精油结果较好，试验误差较小。这4 种方法在测定肉桂精油微胶囊中精油含量时，混合溶剂提取法准确度高，重复性好，为精油最佳的提取方法。