HPLC法测定补骨胶囊中柚皮苷的含量

王 亮，谢宇，罗 君，薛鑫宇，唐靖雯，张丽艳*

(1.贵州中医药大学，贵州贵阳 550025；2.贵州广济堂药业有限公司，贵州贵阳 550014；3.贵州中医药大学第一附属医院，贵州贵阳 550001；4.贵州威门药业股份有限公司，贵州贵阳 550004)

补骨胶囊中中药骨碎补、杜仲、鹿骨粉已被国家卫生健康委员会列为保健食品、中药，将其与现代常用于增加骨密度的营养补充剂骨胶原蛋白粉、碳酸钙、维生素D3相结合，制成以增加骨密度、防止骨质疏松为主要功效的保健食品。方中骨碎补作为伤科的要药，常用于治疗骨伤，具有疗伤止痛、补肾强骨的功效，治疗、预防骨伤疗效显著[1]。现代相关研究表明[2-4]，骨碎补中总黄酮具有抗骨质疏松、促进骨伤愈合的功效，其历史悠久、资源丰富，具有良好的商用价值。为保证本品质量，本处方以骨碎补中柚皮苷为主要评价指标，参考2015版《中国药典》一部“骨碎补”中柚皮苷的含量测定方法[1]，采用HPLC法建立补骨胶囊中柚皮苷的含量测定方法，可有效控制补骨胶囊质量。

1 仪器与试药

98-I-B电子调温电热套(天津市泰斯特仪器有限公司)；ABZ04-S型电子天平(上海梅特勒有限公司)；Agilent1260高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；柚皮苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110722-200309)；甲醇(色谱纯，TEDIA)；补骨胶囊(自制)；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 测定方法

参考2015版《中国药典》一部项下“骨碎补”中柚皮苷的含量测定方法，采用高效液相色谱法测定本品柚皮苷含量。

2.2 色谱条件考察[5-6]

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取柚皮苷对照品20.08 mg，置干燥的25 mL容量瓶内，加50%甲醇定容至刻度，摇匀，即得对照品溶液。(柚皮苷含量以93.4%计，C=750.19 μg/mL)

2.2.2 流动相考察 取柚皮苷对照品溶液，采用甲醇、乙腈、甲醇-水、甲醇-醋酸-水、甲醇-磷酸-水、甲醇-甲酸-水为流动性对柚皮苷对照品溶液进行分析，甲醇和乙腈对比，甲醇较乙腈峰形好。柚皮苷以醋酸、水为流动相时，出峰时间适中。以磷酸和甲酸为流动相时，出峰时间延后。采用甲醇-水时，峰形无变化。选择甲醇-醋酸-水(35∶4∶65)时色谱峰对称性(0.87～1.1)较好，保留时间(10～12)适中。

2.2.3 检测波长选择 取柚皮苷对照品溶液，用HPLC-DAD检测，波长在200～400 nm之间进行全波长扫描，结果显示在283 nm波长处有最大吸收峰且灵敏度高，故确定柚皮苷最大吸收波长为283 nm。

2.2.4 柱温考察 取柚皮苷对照品溶液，分别考察25 ℃、30 ℃、35 ℃下柱温对柚皮苷的保留时间的影响，结果表明柚皮苷的保留时间随着柱温的升高而缩短，在30 ℃时保留时间在10～12 min，保留时间适中。

2.2.5 色谱条件 色谱柱Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇-醋酸-水(35∶4∶65)；流速：1.0 mL·min-1；紫外检测器，检测波长：283 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。理论塔板数按柚皮苷峰计算应不低于3 000。色谱见图1。

A.柚皮苷对照品；B.补骨胶囊供试品；C.阴性样品

2.3 供试品溶液制备考察[7]

2.3.1 提取溶剂考察 取补骨胶囊内容物研细，精密称取0.5 g，共4份，置150 mL具塞锥形瓶中，分别精密加入水、乙醇、甲醇、50%甲醇5 0mL，密塞，精密称定，加热回流30 min，取出，放冷，分别用甲醇、水、乙醇、50%甲醇补足减失重量，摇匀，过滤，滤液用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，按“2.2.5”项下色谱条件测定，结果甲醇作为提取溶剂时色谱峰出现前沿峰，对称性不好，水、乙醇提取物的峰面积较甲醇峰面积小，提取不完全，采用50%甲醇制备补骨胶囊样品时，前沿峰消失，对称性好，故选用50%的甲醇作为提取溶剂。

2.3.2 提取方法考察[8]取补骨胶囊内容物研细，精密称取0.5 g，共12份(以各重复性的RSD结果为评价标准)，置150 mL具塞锥形瓶中，分别精密加50%甲醇50 mL，密塞，精密称定，分别超声和加热回流0.5 h，取出，放冷，用50%甲醇补足减失重量，摇匀，过滤，滤液用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，按“2.2.5”项下色谱条件测定，结果超声样品的重复性的RSD为6.96%，加热回流样品的重复性的RSD为0.27%，故选用加热回流提取样品。

2.3.3 提取时间考察 取补骨胶囊内容物研细，精密称取0.5 g，共6份，置150 mL具塞锥形瓶中，分别精密50%甲醇5 0mL，密塞，精密称定，分别加热回流30 min、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h，取出，放冷，用50%甲醇补足减失重量，摇匀，过滤，滤液用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，按“2.2.5”项下色谱条件测定，结果0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h的柚皮苷含量无明显变化，故选取0.5 h提取样品。

2.3.4 溶剂提取率考察 取补骨胶囊内容物研细，精密称取0.25 g，置250 mL具塞锥形瓶中，分别精密加50%甲醇100 mL，密塞，精密称定，加热回流30 min，取出，放冷，摇匀，过滤，弃去滤液。滤纸和残渣置20 mL具塞锥形瓶中，精密加50%甲醇20 mL，密塞，精密称定，加热回流30 min，取出，放冷，摇匀，过滤，滤液用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，按“2.2.5”项下色谱条件测定，结果用50%甲醇加热回流30 min提取完全，未检出柚皮苷成分峰。

2.3.5 供试品溶液制备 按照以上优选的方法进行补骨胶囊样品提取，即取补骨胶囊内容物研细，精密称取0.25 g，置250 mL具塞锥形瓶中，精密加50%甲醇100 mL，密塞，精密称定，加热回流30 min，取出，放冷，用50%甲醇补足减失重量，摇匀，过滤，滤液用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得补骨胶囊柚皮苷供试品溶液。

2.4 阴性样品溶液制备

按处方取杜仲药材2 g，加10倍量水，加热回流提取2次，每次2 h。过滤，合并滤液，置干燥的50 mL容量瓶内，加甲醇定容至刻度，摇匀，滤液用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得补骨胶囊缺骨碎补阴性样品溶液。

2.5 线性关系考察

取1 mL浓度为750.19 μg/mL的对照品母液至10 mL容量瓶内，加50%甲醇定容至刻度，摇匀，即得对照品溶液，浓度为75.019 μg/mL。再取5个10 mL容量瓶倍半稀释依次得到浓度为37.510 μg/mL、18.755 μg/mL、9.378 μg/mL、4.689 μg/mL、2.345 μg/mL。分别精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，按“2.2.5”项下色谱条件测定。以进样浓度X(μg/mL)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程：Y=17.85X+5.500 9(R2=0.999 9)。结果表明，柚皮苷在2.345～75.019 μg/mL范围内线性关系良好。

2.6 精密度试验

取补骨胶囊内容物研细，精密称取0.25 g，按“2.3.5”项下供试品溶液方法制备供试品溶液，精密吸取9.378 μg/mL对照品溶液10 μL，按“2.2.5”项下色谱条件测定，连续进样6次，记录峰面积。结果，柚皮苷峰面积RSD为0.43%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取补骨胶囊内容物研细，精密称取0.25g，按“2.3.5”项下供试品溶液方法制备供试品溶液，分别于0、1、2、4、8、12、24 h，精密吸取56.768 μg/mL对照品溶液10 μL，按“2.2.5”项下色谱条件测定，记录峰面积。结果补骨胶囊中柚皮苷的峰面积RSD为1.01%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.8 重复性试验

取补骨胶囊内容物研细，精密称取0.25 g，共6份，按“2.3.5”项下供试品溶液方法制备供试品溶液，按“2.2.5”项下色谱条件测定，记录峰面积。结果补骨胶囊中柚皮苷的平均含量为4.16 mg/g，RSD为1.25%，表明本方法的重复性良好。

2.9 加样回收率试验

取已知含量的样品6份，每份约0.125 g，精密称定，分别精确加入柚皮苷对照品溶液(0.005 2 mg/mL)100 mL，按“2.3.5”项下方法制备供试品溶液，共6份，按“2.2.5”项下色谱条件测定，记录峰面积，按照外标一点法计算样品含量及加样回收率。结果表明，加样回收率为96.21%，在回收率限度90%～108%之间，RSD在3%以内，该含量测定方法回收率高，符合测定要求。结果见表1。

表1 柚皮苷加样回收率试验

2.10 样品含量测定

分别取3批不同批号的补骨胶囊内容物研细，各精密称取0.25 g，按“2.3.5”项下供试品溶液方法制备供试品溶液，按“2.2.5”项下色谱条件测定，记录峰面积，按外标一点法计算补骨胶囊样品含量。结果见表2。

表2 样品含量测定 (n=3，%)

3 讨论

本实验采用HPLC建立补骨胶囊中柚皮苷含量测定方法，该方法简便准确、重复性好、灵敏度高、分离度良好、测定方法稳定可行，可有效控制补骨胶囊的质量。