北部湾海绵Siphonochalina flexa共附生细菌多样性及抑甘蔗鞭黑粉菌活性研究

江蕾 李蜜 李智 易湘茜 高程海 周桂

摘  要  分离纯化广西怪石滩海域海绵可培养共附生细菌，分析其多样性并研究共附生细菌发酵产物对甘蔗鞭黑粉菌的抑制活性，为研发新型生物农药提供参考依据。采用8种培养基分离纯化海绵共附生细菌，运用16S rDNA测序方法进行菌种鉴定及多样性分析，采用牛津杯法测试细菌发酵产物对甘蔗鞭黑粉菌的抑制效果。经形态学分析及16S rDNA比对，海绵中共获得34株共附生细菌，隶属于18科24属。活性检测结果表示，存在14株对甘蔗鞭黑粉菌有抑制效果的菌株。海绵中可培养共附生细菌物种多样性丰富，部分菌株的发酵产物对甘蔗鞭黑粉菌具有较强的抑制效果，有成为新型生物农药的潜力。

关键词  海绵;共附生细菌;物种多样性;甘蔗鞭黑粉菌;抑菌活性

中图分类号  S566.1      文献标识码  A

Abstract  The purpose of this study was to investigate the distribution and the diversity of co-bacteria of Siphonochalina flexa isolated from Guaishi sea beach and to study its antifungal activities of the fermentation liquids against Sporisorium scitamineum. Eight different isolation media were used to isolate and purify the co-bacteria from S. flexa. The 16S rDNA was employed to explore the diversity of the isolated strains. The effects of the fermentation liqiuds against S. scitamineum were tested with the method of Oxford cup. After the morphological analysis and 16S rDNA alignment， 34 strains of co-bacteria were isolated from S. flexa， belonging to 18 families and 24 genera. Through testing the antifungal activities， we screened 14 kinds of bacteria that had the inhibitory effect on S. scitamineum. The cultivated bacteria in S. flexa were rich in species and most of them showed strong activity of against S. scitamineum.

Keywords  Siphonochalina flexa; co-bacteria; species diversity; Sporisorium scitamineum; antifungal activities

DOI  10.3969/j.issn.1000-2561.2019.07.025

甘蔗是廣西主要的经济作物，也是该地区的支柱产业，但其产量往往受制于甘蔗黑穗病[1]。甘蔗鞭黑粉菌（Sporisorium scitamineum）是引起甘蔗黑穗病的主要原因，目前世界上对其防治主要集中在强化育种、加强检疫和抗性基因研究，但这些对于遏制甘蔗黑穗病的发生都没有很好的作用[2]。嘧菌酯、啶酰菌胺等化学农药常被用于防治甘蔗黑穗病[3-4]。虽然化学农药可用于防控甘蔗黑穗病，但会严重污染大气和水环境，同时增强甘蔗鞭黑粉菌抗药性。因此寻找防治甘蔗鞭黑粉菌的生物农药，对蔗种消毒、宿根及枝叶防治，降低初次侵染率和减少孢子传播，对甘蔗优化种植、提高产量等有着重要意义。

生物防治作为植物病害防治的重要组成部分，越来越得到世界各国的重视并发挥着重要的作用[5]。廖咏梅等[6]从甘蔗根际土壤及其不同组织内分离出的928株菌中，筛选得到18株菌对甘蔗黑穗病菌有强拮抗作用，其中12株为芽孢杆菌。熊国如等[7]在海南蔗区甘蔗根际土壤微生物中筛选得到1种能抑制甘蔗黑穗病菌的菌株，并在盆栽试验的防效表现也很好，该株细菌为枯草芽孢杆菌。李菲等[8]对分离自广西北海金海湾红树植物秋茄中的50株内生细菌进行抑制甘蔗鞭黑粉菌的活性筛选，结果显示有37株对甘蔗鞭黑粉菌有抑制活性。

广西海域地处亚热带，蕴藏着丰富的海洋微生物资源[9]，但关于该海域海绵共附生细菌方面的研究报道较少，而利用菌株发酵产物抑制甘蔗鞭黑粉菌的海洋细菌更是鲜见。对广西防城港怪石滩海域的海绵中可培养共附生细菌进行多样性分析，并利用甘蔗鞭黑粉菌对细菌次级代谢产物进行活性的初步筛选，为该海域细菌资源的开发利用及研发生物类农药奠定基础。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  海绵样本来源、预处理及其共附生细菌的分离纯化  海绵样品于2016年10月采集自广西防城港怪石滩（E 108°22， N 21°49）水下5 m，由广西中医药大学高程海研究员鉴定为弯曲管指海绵（Siphonochalina flexa）。海绵表面用无菌水冲洗三遍，取1 cm1 cm新鲜海绵大约2 g加入1 mL无菌水研磨，研磨后液体保存于1.5 mL离心管中，待用。将研磨后液体作为样品原液，依次稀释到103浓度，取稀释后102、103样液0.2 mL，分别接种于M4、M5、M6、M7、M9、2216E、Gause No. 1、AGG这8种不同分离培养基中培养基配方如表1所示（所有培养基需加入复合盐溶液10 mL，琼脂20 g，并调节pH 7.2，于115 ℃灭菌30 min，待温度降到55 ℃时加入0.5 mL 25 mg/L的重铬酸钾以抑制真菌生长），28 ℃恒温培养箱培养15 d，通过形态观察挑选菌落，记录菌落形态特征及数量，并挑选形态各异的菌落进行划线纯化。纯化后的菌株制成冻干牛奶管于4 ℃低温保藏，同时制成20%甘油管于80 ℃冷冻保藏。

1.1.2  供试菌采集及保存  甘蔗鞭黑粉菌冬孢子于2017年5月采自广西金光农场，采集新鲜甘蔗黑鞭（冬孢子），轻轻敲打黑鞭，将冬孢子装于封口袋中，4 ℃冰箱保存备用。

1.2  共附生细菌16S rDNA系统发育分析

采用Chelex-100法[10]提取菌种的DNA，参照Walsh等[11]的方法进行PCR扩增。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像仪检验条带，合格样品测序委托上海美吉生物医药技术有限公司广州分公司进行。测序结果经DNA Star软件整理，利用EzTaxon服务器（http：//www.eztaxon.org/）[12]及Blast网站进行在线比对;选取高同源性序列作为参比对象，运用MEGA5.0软件，Neighbor- Joining法构建系统发育树并分析各菌株的系统发育地位[13]。

1.3  共附生细菌对甘蔗鞭黑粉菌的抑制实验

1.3.1  细菌粗提物的制备  参照覃媚等[14]的方法，将34株处于对数生长期的细菌接种发酵7 d，破壁处理后萃取浓缩得到细菌粗提物，并置于干燥器低温保存。

1.3.2  甘蔗鞭黑粉菌担孢子与菌丝的制备  参照Singh等[15]和朱桂宁等[3]的方法，取少量（绿豆大小）冬孢子与10 mL无菌水混匀，稀释涂布多个浓度梯度，观察其萌发状况，经过试验发现103浓度萌发最佳。用接种环挑取适量（芝麻大小）萌发后冬孢子与1 mL无菌水混匀，稀释涂布多个梯度，经试验验证105浓度最佳，取200 μL 105浓度液涂布于PDA培养基，于28 ℃培养3～5 d，观察其生长状况，孢子萌发过程中未发现有细菌滋生。选取5～7个酵母形态菌落，分别接种于YEPS液体培养基中，180 r/min，28 ℃培养2 d，取少量菌液于PDA培养基上进行交叉配型，运用排列组合方式两两交叉培养，菌落为白色绒毛状，则两菌株为异型（+、）交配型单倍体担孢子。若菌落为酵母形态，则两菌株为同型（+、+或、）交配型单倍体担孢子[3]。

1.3.3  抑制甘蔗鞭黑粉菌担孢子及菌丝生长活性鉴定  （1）待试菌板的制备：分别挑取2种异型担孢子接种于50 mL YEPS液體培养基，于28 ℃、180 r/min的摇床中培育36～48 h。参照李菲等[8]的方法制备待试菌板。

（2）抑菌活性测定：采用牛津杯法[16]检测34株细菌抑制甘蔗鞭黑粉菌活性。用一定量生物级DMSO溶解配制细菌粗提物样品，粗提物样品浓度为10 mg/mL，再用一次性过滤器过滤样品。空白对照为DMSO溶剂，阳性对照为5 μg/mL啶酰菌胺溶液。每个牛津杯加入药液100 μL，置于28 ℃培养箱培养，培养5 d后，利用垂直十字交叉法测量各抑菌圈的直径。

2  结果与分析

2.1  海绵中可培养共附生细菌多样性分析

本研究采用8种分离培养基，从海绵中分离到48株共附生细菌，根据菌落的大小、形态、颜色和出现时间等特征进行排重。大部分菌株呈现浅色系、白色、浅红色和浅黄色等，少数为黄褐色、棕褐色和橘黄色，多出现于3～4 d，直径大小主要集中在1～6 mm。经过形态特征与16S rDNA排除重复后得到34株菌株，其形态特征详情如表2所示。获得34株共附生细菌，隶属于4门18科24属，详情见表3。其中，菌株BGMRC03076 Gordonia bronchialis相似度为97%，极有可能为潜在新种。根据共附生菌株与相似菌株的16S

2.2  海绵中细菌发酵产物抑制甘蔗鞭黑粉菌的活性分析

34株细菌的发酵代谢产物经抑制甘蔗鞭黑粉菌的活性筛选，结果显示存在10株细菌具有抑制鞭黑粉菌菌丝生长活性，6株细菌能抑制鞭黑粉菌“+”担孢子，7株细菌能抑制鞭黑粉菌“”型担孢子，部分抑菌结果如图（图2A，图2B，图2C）。其中，有2株同时具有抑制3种甘蔗鞭黑粉菌形态的活性（表4）。阳性对照组（5 μg/mL啶酰菌胺溶液100 μL）出现明显抑菌圈，抑菌圈直径为（23.0±2.0） mm，阴性对照组未出现抑菌圈。活性菌株中分别包含12个属，放线菌属（Acineto bacter）2株，分枝杆菌属（Mycobacterium）2株，节细菌属（Arthr obacter），芽孢杆菌属（Bacillus），柠檬酸杆菌属（Citr obacter），埃希氏杆菌属（Escherichia），戈登氏菌属（Gordonia），细杆菌属（Microb acterium），小单孢菌属（Micro monos po ra），根瘤菌属（Rhiz obium），红球菌属（Rhodo coc cus），Sphingopyxis菌属分别1株。其中菌株BGM RC03066芽孢杆菌属的Bacillus siamensis对“+”担孢子的抑制活性最强，抑菌圈直径达到（25.40±0.85）mm，和阳性组比较具有显著抑制活性。

3  讨论

海绵生活在海洋环境，常常与共附生微生物共同生存，以互惠互利或一方受益的方式共生、寄生或共栖[17]。李菲等[8]、王伟[17]与刘欢等[18]先后报道了关于海绵共附生细菌多样性的研究进展。目前，关于海绵的研究偏重于自身[19]与其共附生真菌代谢产物[20]的化学成分及活性研究，针对其共附生细菌的多样性及发酵产物的活性研究较少。

本研究选择广西防城港怪石滩海域的海绵进行其共附生细菌多样性分析。采用8种不同的分离培养基分离纯化海绵中的共附生细菌，分离培养共附生细菌34株，隶属于18科24属。采用牛津杯法测定34株共附生细菌对甘蔗鞭黑粉菌的抑制活性，结果显示，14株细菌具有良好的抑菌活性，总阳性率为41.2%。其中，BGMRC03066与BGMRC03081对甘蔗鞭黑粉菌菌丝及担孢子（+、）都有不同程度的抑制作用，且抑制效果较好。BGMRC03066与BGMRC03081分别隶属芽孢杆菌属和微杆菌属，其中尤以芽孢杆菌属的抑菌效果最好，此结果与李菲等[8]和廖咏梅等[6]的结果相似。由此可见芽孢杆菌属具有较强的抑菌活性，下一步将对抑菌活性较好的菌株进行发酵条件的优化，并分析其发酵代谢产物的化学组成及其抑菌机理，以期为新型生物农药的开发与利用奠定基础。

广西防城港海域海洋生物多样化，海洋生物蕴藏着丰富的细菌资源，且活性菌株较多，因此从海绵共附生细菌中寻找具有抗农业病原真菌的活性菌株，利用海洋可再生资源解决农业实际问题可成为新的研究方向。

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