不同产地刺五加中多糖含量测定、聚类分析及其超声提取工艺优化

李俊萍 郭盛磊 王谦博 付士朋 王振月

摘 要 目的：建立测定刺五加中多糖含量的方法，并对其进行聚类分析及超声提取工艺优化。方法：采用硫酸-苯酚法测定刺五加中多糖的含量。采用SPSS 23.0软件对17个不同产地刺五加进行聚类分析。采用L9（34）正交试验设计以提取温度、料液比、提取时间为考察因素，多糖含量为考察指标对其超声提取工艺进行优化并验证。结果：葡萄糖质量浓度线性范围为0.007 75～0.151 mg/mL（r=0.999 1）;定量限、检测限分别为2.854、0.856 μg/mL;精密度、稳定性、重复性试验的RSD均小于2%;加样回收率为98.41%～101.58%（RSD=1.23%，n=6）。聚类分析结果显示，17批药材样品可聚为3类，S1、S6、S10、S12、S13聚为一类，S3～S5、S7聚为一类，其余聚为一类。最优超声提取工艺为提取温度55 ℃、料液比1 ∶ 10（g/mL）、提取时间35 min;3次验证试验结果显示，最优工艺所得多糖平均含量为4.36% （RSD=0.92%，n=3）。结论：所建含量测定方法操作简便、重复性较好，可用于测定刺五加中多糖含量;优化后的超声提取工艺稳定、可行。

关键词 刺五加;多糖;硫酸-苯酚法;含量测定;正交试验;超声提取工艺;聚类分析

ABSTRACT   OBJECTIVE： To establish a determination method for content of polysaccharide in Acanthopanax senticosus， and to conduct cluster analysis and ultrasonic extraction technology optimization. METHODS： The content of polysaccharide in A. senticosus was determined by phenol-sulfuric acid method. Cluster analysis was conducted by using SPSS 23.0 software of the polysaccharide in A. senticosus from 17 habitats. The ultrasonic extraction technology was optimized with L9（34）orthogonal test using extraction temperature， the ratio of material to liquid， extraction time as factors， the content of polysaccharides as index， and then validated. RESULTS： The linear range of glucose ranged from 0.007 75 to 0.151 mg/mL （r=0.999 1）; the limits of quantification and detection were 2.854， 0.856 μg/mL; RSDs of precision， stability， and repeatability tests were less than 2%; recovery rates of the sample were 98.41%-101.58%（RSD=1.23%，n=6）. Cluster analysis results showed that 17 batches of samples could be clustered into three classes; S1， S6， S10， S12 and S13 were clustered into one class; S3-S5 and S7 were clustered into one class; and the rest samples were clustered into one class. The optimal ultrasonic extraction technology was extraction temperature 55 ℃， ratio of material to liquid 1 ∶ 10 （g/mL）， extraction time 35 min. Results of validation tests showed the content of the polysaccharide under the best process condition was 4.36%（RSD=0.920%，n=3）. CONCLUSIONS： Established method is simple，reproducible and suitable for determination of polysaccharide in A. senticosus; the optimized ultrasonic extraction technology is stable and feasible.

KEYWORDS   Acanthopanax senticosus; Polysaccharide; Phenol-sulfuric acid method; Content determination;Orthogonal test; Ultrasonic extraction technology; Cluster analysis

刺五加為五加科植物刺五加[Acanthopanax seuticosus（Rupr. et Maxim.）Harms]的干燥根、根茎或茎，具有益气健脾、补肾安神的功效[1]，是我国东北地区珍贵的药用植物[2]。刺五加中含有多糖、三萜皂苷类、黄酮类、木脂素类、香豆素类等多种活性成分[3-4]。现代研究表明，刺五加中的多糖成分具有调节免疫、抗肿瘤、抗氧化、降血糖等药理作用，现已成为研究的热点[5]。

目前，关于刺五加中多糖的研究多集中在药理作用等方面[6-7]，而对其含量的研究较少。虽然霍文等[8]比较了产自本溪、穆枝、珲春刺五加中多糖的含量，但样本量较少、结论缺乏代表性。此外，刺五加中多糖的提取常采用煎煮法和回流法，但提取时间长、操作繁琐，提取率低[9-10]。有研究认为，与上述提取方法相比，超声提取法具有省时、高效、能耗低等优点，并且可以大幅度地提高多糖的提取率[11]。基于此，本研究采用硫酸-苯酚法测定了刺五加中多糖的含量，并对17个不同产地刺五加进行聚类分析;同时，采用正交试验设计以提取温度、料液比、提取时间为考察因素，多糖含量为考察指标对其超声提取工艺进行优化，旨在为其相关产品的开发利用提供参考。

1 材料

1.1 仪器

H1650型台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）;BGZ-240型真空干燥箱（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）;FW100型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）;Spectra Max M2型多功能酶标仪[美谷分子仪器（上海）有限公司];KM-822C型超声波清洗器（广州市科洁盟实验仪器有限公司）;AE240型电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 药品与试剂

葡萄糖对照品（天津市大茂化学试剂厂，批号：20170801，纯度：≥99%）;浓硫酸、苯酚均为分析纯，水为蒸馏水。

1.3 药材

刺五加药材采自黑龙江省和吉林省的17个不同产地，经黑龙江中医药大学药学院王振月教授鉴定为五加科植物刺五加[Acanthopanax seuticosus（Rupr. et Maxim.）Harms]的茎。将药材样品于45 ℃烘干至恒定质量，粉碎后过60目筛，备用。药材样品来源见表1。

2 方法与结果

2.1 刺五加中多糖含量测定

采用硫酸-苯酚法测定刺五加中多糖的含量[12]。

2.1.1 供试品溶液的制备 取药材样品1.0 g，置于干燥锥形瓶中，称定质量，超声（功率：480 W，频率：40 kHz，下同）提取，提取温度55 ℃，料液比1 ∶ 10（g/mL，下同），提取时间35 min后，取出放冷，再次称定质量，用水补足减失的质量，混匀，取提取液2 mL，置于离心管中，以4 000 r/min离心10 min，取上清液1.0 mL，置于50 mL量瓶中，加水定容，即得供试品溶液。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取经105 ℃干燥至恒定质量的葡萄糖对照品7.55 mg，置于50 mL量瓶中，加水溶解并定容，制成质量浓度为0.151 mg/mL的对照品溶液。

2.1.3 空白对照溶液 以水为空白对照溶液。

2.1.4 检测波长的确定 精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液各2.0 mL，分别置于10 mL具塞试管中，加苯酚1.0 mL，混匀，加浓硫酸5.0 mL，摇匀后于室温下放置30 min，于200～800 nm波长下进行全波长扫描。另取空白对照溶液2.0 mL，于200～800 nm波长下进行全波长扫描。结果显示，对照品溶液和供试品溶液在490 nm波长处有最大吸收，空白对照溶液在490 nm波长处没有吸收，故选择检测波长为490 nm，详见图1。

2.1.5 线性关系考察 分别精密量取“2.1.2”项下对照品溶液0.1、0.2、0.6、1.0、1.4、2.0 mL，置于2 mL具塞试管中，加水稀释至2 mL，得到质量浓度分别为0.007 75、0.015 1、0.045 3、0.075 5、0.105 7、0.151 mg/mL的系列线性关系工作溶液，按“2.1.4”项下方法显色后，于490 nm波長处测定吸光度。以葡萄糖质量浓度（x，mg/mL）为横坐标、吸光度（y）为纵坐标进行线性回归，得多糖回归方程为y=8.730 4x+0.026 2（r=0.999 1），表明葡萄糖质量浓度在0.007 75～0.151 mg/mL范围内线性关系良好。

2.1.6 定量限与检测限考察 取“2.1.2”项下对照品溶液适量，按“2.1.4”项下方法显色后，于490 nm波长处测定吸光度并计算标准偏差。以标准偏差与标准曲线斜率之比的10倍对应的质量浓度作为定量限，以标准偏差与标准曲线斜率之比的3倍对应的质量浓度作为检测限。结果，定量限为2.854 μg/mL，检测限为0.856 μg/mL。

2.1.7 精密度试验 精密量取“2.1.2”项下对照品溶液2.0 mL，按“2.1.4”项下方法显色后，于 490 nm波长处连续测定6次吸光度。结果，吸光度的RSD为0.047%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.1.8 稳定性试验 精密量取“2.1.1”项下供试品溶液（编号：S1）2.0 mL，按“2.1.4”项下方法显色后，分别在室温下放置2、4、6、8、12、24 h时于490 nm波长处测定吸光度。结果，吸光度的RSD为0.126%（n=6），表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定性良好。

2.1.9 重复性试验 取药材样品（编号：S1）1.0 g，共6份，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.4”项下方法显色后，于490 nm波长处测定吸光度并按标准曲线法计算样品中多糖的含量。结果，多糖的平均含量为4.36%，含量的RSD为1.36%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.1.10 加样回收率试验 取已知含量的药材样品（编号：S1），共6份，每份约1.0 g，精密加入葡萄糖对照品44.0 mg，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.4”项下方法显色后，于490 nm波长处测定吸光度并计算加样回收率，结果见表2。

2.1.11 样品含量测定 取17批药材样品适量，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.4”项下方法显色后，于490 nm波长处测定吸光度并按标准曲线法计算多糖含量，各样品平行操作3次，结果见表3。

2.2 聚类分析

以多糖含量为变量，采用SPSS 23.0软件对数据进行标准化处理，以平方欧氏距离为测度进行聚类分析，结果见图2。由图2可知，17批药材样品可聚为3类，S1、S6、S10、S12、S13聚为一类，刺五加中多糖平均含量为 4.26%～4.79%;S3～S5、S7聚为一类，刺五加中多糖平均含量为6.44%～7.91%;其余聚为一类，刺五加中多糖平均含量为5.11%～5.79%。

2.3 单因素试验

2.3.1 提取温度对刺五加中多糖含量的影响 取药材样品（编号：S1）1.0 g，置于干燥锥形瓶中，在超声提取30 min，料液比1 ∶ 20条件下，考察不同提取温度（25、35、45、55 ℃）对刺五加中多糖含量的影响，各水平重复操作3次（下同），结果见图3A。由图3A可知，当提取温度为55 ℃时，刺五加中多糖含量最高，故选择提取温度范围为45～65 ℃。

2.3.2 料液比对刺五加中多糖含量的影响 取药材样品（编号：S1）1.0 g，置于干燥锥形瓶中，在超声提取30 min，提取温度55 ℃条件下，考察不同料液比为（1 ∶ 10、1 ∶ 20、1 ∶ 30、1 ∶ 40、1 ∶ 50）对刺五加中多糖含量的影响，结果见图3B。由图3B可知，当料液比为1 ∶ 20时，刺五加中多糖含量最高，故选择料液比范围为1 ∶ 10～1 ∶ 30。

2.3.3 提取时间对刺五加中多糖含量的影响 取药材样品（编号：S1）1.0 g，置于干燥锥形瓶中，在提取温度55 ℃，料液比为1 ∶ 20条件下，考察不同提取时间（15、25、35、45、55 min）对刺五加中多糖含量的影响，结果见图3C。由图3C可知，当提取时间为45 min时，刺五加中多糖含量最高，故选择提取时间范围为35～55 min。

2.4 刺五加多糖提取工艺优化

2.4.1 正交试验设计 在单因素试验基础上，以提取温度（A）、料液比（B）、提取时间（C）为考察因素，多糖含量为考察指标，采用L9（34）正交试验设计优化工艺，因素与水平见表4，正交试验设计方案与结果见表5，方差分析结果见表6。

由表4可知，各因素对刺五加中多糖含量的影响顺序依次为B>A>C，其中A2>A1>A3、B1>B2>B3、C3>C1>C2。进一步方差分析可知，提取温度和料液比对刺五加中多糖含量影响显著（P<0.05）。因此，从省时降耗及生产实际出发，在保证提取充分的前提下，综合分析各因素的影响，得最优提取工艺为A2B1C1，即提取温度55 ℃、料液比1 ∶ 10、提取时间35 min。

2.4.2 验证试验 在此最优提取工艺条件下，平行操作3次。结果，刺五加中多糖的平均含量为4.36%（RSD=0.92%，n=3），提示该提取工艺稳定、可行。

3 讨论

含量测定结果显示，17个不同产地刺五加中多糖含量存在差异，其中S7（勃利福兴林场）刺五加中多糖的平均含量最高，为7.91%，S12（饶河大顶子山）刺五加中多糖的平均含量最低，4.26%。其原因可能与中药品质的形成除受到植物遗传作用外，还与土壤、海拔、水分、日照和地形等环境因素有关[13-15]。聚类分析结果显示，17批药材样品可聚为3类，S1、S6、S10、S12、S13聚为一类，S3～S5、S7聚为一类，其余聚为一类。这可能与药材生长的地理位置、生态环境有关[15]。

与传统煎煮工艺相比，超声波产生的强烈振动、超快速度、空化效应及搅拌作用等因素均可加速药材中的有效成分的溶出，具有提取效率高、提取时间短、溶剂用量少等优点[16-18]，故本研究参考上述相关文献，采用超声提取法进行提取。

本研究得到的最优提取工艺为提取温度55 ℃、料液比1 ∶ 10、提取时间35 min。在此条件下，刺五加中多糖的平均含量为4.36%，提示工艺稳定、可行。

综上所述，本研究所建含量测定方法操作简便、重复性较好，可用于测定刺五加中多糖含量;优化后的提取工艺稳定、可行。

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（收稿日期：2019-04-08 修回日期：2019-06-18）

（编辑：陈 宏）