替考拉宁产生菌的诱变选育

王凤亚

摘要：目的：本文对替考拉宁产生菌进行了诱变选育，以期获得替考拉宁高产菌株。方法：通过在固体培养基中添加不同浓度替考拉宁筛选耐自身抗性菌株，再结合紫外诱变加氯化锂的方法，筛选出高产替考拉宁菌株。结论：在研究过程中通过耐自身抗性结合诱变选育，筛选出了替考拉宁高产菌，使发酵单位提高48.5%。

关键词：替考拉宁产生菌;抗性选育;紫外诱变加氯化锂

替考拉宁，别称肽可霉素，是一种糖肽类抗生素，主要由游动放线菌产生。替考拉宁可以应用在多重耐药菌感染治疗方面。通过相关研究表明，替考拉宁不仅可以消灭革兰氏阳性菌，而且对多重耐药的肠球菌、金黄色葡萄球菌具有明显的抗菌活性。在治疗金黄色葡萄球菌时，普遍应用万古霉素;但随着替考拉宁作用的不断挖掘，替考拉宁在金黄色葡萄球菌的治疗方面得到了广泛应用。现阶段金黄色葡萄球菌问题日益突出，替考拉宁、万古霉素的需求量日益增加。与替考拉宁相比，万古霉素的毒副作用相对较高，在体内的半衰期较短，因此替考拉宁在治疗金黄色葡萄球菌方面更具优势。为了将替考拉宁的作用充分发挥，需要提高替考拉宁的产量，因此相关学者在替考拉宁产量方面进行了大量研究。本项研究通过添加不同浓度替考拉宁筛选耐自身抗性菌株，再结合紫外诱变加氯化锂的方法，筛选出高产替考拉宁菌株。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株

替考游动放线菌T16-4-18，该菌株由华北制药华胜有限公司研发试验室编号并保藏。

1.1.2培养基组分

（1）固体培养基及斜面培养基：FeSO4·7H2O0.04g/L、葡萄糖1.0g/L、酵母粉2.0g/L、MgSO4·7H2O0.6g/L、KCI6.0g/L、K2HPO41.0g/L、PH7.0～7.2。

（2）种子培养基：蛋白胨2.0g/L、糊精4.0g/L、可溶性淀粉24g/L、CaCO32.0g/L、酵母粉6.0g/L、PH7.0～7.2。

（3）发酵培养基：玉米浆16g/L、糊精12g/L、可溶性淀粉20g/L、CaCO32.0g/L、黄豆粉24g/L、PH6.8～7.0。

1.1.3试剂

替考拉宁（本公司自制粗粉），氯化锂购自天津科密欧化学试剂有限公司。

1.2方法

1.2.1替考拉宁在自身抑制方面的情况

1.2.1.1将替考拉宁配置成不同濃度的溶液，经过滤除菌，将其涂布在固体平板培养基上。在含有不同浓度的替考拉宁产品的平板培养基上涂布未经处理的替考拉宁孢子悬液，28℃培养;培养过程中对孢子的生长情况进行密切观察。

1.2.2抗性菌株的选育

无菌落生长的平板所含替考拉宁浓度即为最小抑菌浓度，在含有最小抑菌浓度替考拉宁的平板培养基上涂布菌株T16-4-18孢子悬液，筛选出存在抗性突变的菌株。

1.2.3紫外诱变结合氯化锂进行诱变选育

1.2.3.1将氯化锂加入到灭菌后的固体培养基中，摇匀倒碟子，保证每个平板含有0.5%氯化锂。

1.2.3.2取新鲜斜面1支，加入无菌纯化水后刮下，用玻璃珠打碎10min，制备成孢子液。将孢子液UV照射100s，将照射后的孢子液稀释到-2、-3、-4，在红光下分别涂布到含有0.5%氯化锂的平板上;未经照射的孢子液（自然分离）稀释到-4、-5、-6进行涂布。

1.2.3.3平板培养成熟后，挑选一定数量单菌落接种斜面，培养后接种摇瓶和发酵瓶，测定发酵瓶效价。

2结果与分析

2.1替考拉宁在自身抑制方面的情况

研究人员配置相应浓度的替考拉宁成品溶液，使用相应的方法进行过滤除菌，研究人员将处理过后的替考拉宁成品溶液与未经处理的替考拉宁成品溶液分别涂布在不同的平皿上，并对菌落的生长情况进行观察。研究人员发现，随着替考拉宁浓度的不断增加，孢子生长的时间逐渐延长，并且生长速度逐渐放缓，当涂布有0.012g替考拉宁时，孢子几乎不会生长。

研究人员为了更好的分析在替考拉宁产生菌的发酵过程中，是否自身代谢产物会对发酵过程产生抑制，在接种时将0-30mg/L的替考拉宁成品加入到发酵液当中，在发酵培养8天之后，对其效价进行测定。当替考拉宁的添加浓度控制在5mg/L至15mg/L之间时，替考拉宁的效价呈现增长的状态，但是增长相对缓慢;如果添加浓度为20mg/L，替考拉宁的效价会逐渐下降;如果添加浓度在30mg/L，替考拉宁的效价会受到严重的影响。

2.2抗性菌株的选育

菌悬液经紫外线照射600s，暗培养2小时，将其在含有0.012g替考拉宁的平板上进行涂布，28℃培养。挑选出相应数量的菌落接种斜面，对其发酵水平进行对比分析。通过筛选获得了具有较高生产能力的菌株，编号T-18-043，其发酵效价比出发菌株提高21.2%。

2.3紫外诱变结合氯化锂进行诱变选育

将通过抗性选育出的菌株TC-18-043制备成孢子液，UV照射100s后涂布在含有0.5%氯化锂的平板上，28℃培养。平板培养成熟后挑选出相应数量的菌落接种斜面，并进行发酵效价测定。UV结合氯化锂复合诱变致死率为90%，通过复合诱变选育出高产菌株TC-18-192，发酵效价比出发菌株提高22.5%，比原始菌株提高48.5%。

3讨论

对于抗生素产生菌而言，其对自身所产抗生素的耐受能力有所不同，低产菌株的耐受能力相对较差，高产菌株的耐受能力相对较好。本项研究对替考拉宁产生菌的抗性进行筛选，在筛选的过程中利用紫外诱变，从而筛选出了高产菌株T-18-043，使替考拉宁效价提高21.2%。将选育出的高产菌株T-18-043再进行紫外诱变，涂布在含有氯化锂的平板上，筛选出高产菌株TC-18-192，发酵效价比出发菌株提高22.5%。综上，通过对原始菌株T16-4-18进行抗性筛选后，再进行紫外诱变结合氯化锂的方法进行选育，得到高产菌株比原始菌株效价提高48.5%。

徐波等研究人员利用其它技术筛选出了可以将替考拉宁产量提高65%以上的融合菌株。在以后的工作中会继续对菌种进行筛选，并不断尝试新型的选育方法，通过这样的方式将替考拉宁的耐受性逐步提高。希望通过本项研究，可以为相关人员的后续研究提供借鉴。

参考文献：

[1]白芳静， 左良成， 尤春静，等. 替考拉宁产生菌耐自身抗性变株的选育[J]. 畜牧与饲料科学， 2015（7）：98-99.

[2]吴军营， 张永红， 田雪虹，等. 替考拉宁产生菌醋酸钠抗性变株的选育[J]. 河北化工， 2012（5）：31-31.

[3]金志华， 王明蓉. 替考拉宁产生菌TA2—2组分高含量菌种的推理选育[J]. 中国抗生素杂志， 2010， 25（2）：94-96.

（作者单位：华北制药华胜有限公司）