中华绒螯蟹致病性维氏气单胞菌的分离鉴定、药敏特性及其组织病理学观察

周慧华 黄晓东 安健 曹海鹏 杨先乐

摘要：【目的】查明引起江苏省连云港市某养殖场中华绒螯蟹死亡的病原菌及其药敏特性与组织病理特征，为该病的临床诊断和药物防控提供科学依据。【方法】采用传统方法从患病中华绒螯蟹肝胰腺组织中分离病原菌，通过人工回归感染试驗确定其致病性，利用API ID32E细菌生化鉴定试剂条和16S rRNA序列分析对病原菌进行鉴定，以纸片扩散法测定病原菌的药敏特性，并通过常规石蜡切片观察患病中华绒螯蟹肝胰腺和肠道等病灶组织的病理特征。【结果】从患病中华绒螯蟹肝胰腺中分离获得1株具有致病性的病原菌株（HXH1），经生理生化特性鉴定和16S rRNA序列分析确定其为维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）。HXH1菌株对健康中华绒螯蟹的半数致死剂量（LD50）为6.92×104 CFU/mL，对复方新诺明、杆菌肽、奈替米星、氟苯尼考、多粘菌素B、新霉素、庆大霉素、氧氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、卡那霉素、磺胺异噁唑、链霉素和甲氧嘧啶等14种抗生素高度敏感，对罗红霉素中度敏感，对多西环素、萘啶酸、阿莫西林、四环素和吡哌酸等5种抗生素已产生耐药性（不敏感）。与健康中华绒螯蟹相比，患病中华绒螯蟹的肝胰腺和肠道存在明显病理变化，具体表现为：肝胰腺细胞排列极其紊乱，局部可见坏死细胞，细胞核固缩深染;局部肠黏膜上皮组织溶解脱落至肠腔内。【结论】维氏气单胞菌对中华绒螯蟹具有较强的致病性，通过引起肝胰腺和肠道等器官组织的病理变化而造成机体损伤甚至死亡，养殖生产上可选用喹诺酮类、氨基糖苷类、磺胺类和酰胺醇类渔用抗生素进行防治。

关键词： 中华绒螯蟹;维氏气单胞菌;分离鉴定;药敏特性;组织病理特征

中图分类号： S945.6                                    文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）08-1851-09

Isolation， identification and antibiotic susceptibility of pathogenic Aeromonas veronii in Eriocheir sinensis and its histopathological observations

ZHOU Hui-hua1，2，3， HUANG Xiao-dong1，2，3， AN Jian4， CAO Hai-peng1，2，3*，

YANG Xian-le1，2，3

（1National Pathogen Collection Center for Aquatic Animals（Shanghai Ocean University）， Shanghai  201306， China;

2Shanghai Engineering Research Center for Aquaculture（Shanghai Ocean University）， Shanghai  201306， China;

3Shanghai Collaborative Innovation for Aquatic Animal Genetics and Breeding（Shanghai Ocean University）， Shanghai 201306， China; 4Lianyungang City Oceanic and Fishery Development Center， Lianyungang， Jiangsu  222000， China）

Abstract：【Objective】The present study was conducted to investigate the bacterial pathogen that caused the death of Eriocheir sinensis farmed in Lianyungang， Jiangsu and determine its antibiotic susceptibility and histopathological characterization in order to provide reference for clinical diagnosis and effective control of this disease in E. sinensis aquaculture.【Method】Bacterial isolates were isolated from naturally infected E. sinensis using traditional methods and the pathogenicity was determined by artificial infection test. The pathogenic isolate was identified by API ID32E biochemical identification reagent strip and 16S rRNA sequence analysis. Its antibiotic susceptibility was tested by disc diffusion method， and the histopathological characterization of pancreas and intestinal tract the diseased E. sinensis was further observed by conventional paraffin section technique. 【Result】The pathogenic strain HXH1 was isolated from hepatopancreas of diseased E. sinensis and was identified as Aeromonas veronii based on phenotypic characteristics and 16S rRNA sequences analysis. It had an median lethal dose（LD50） of 6.92×104 CFU/mL for healthy E. sinensis and showed high susceptibility to compound sulfamethoxazole， bacitracin， netilmicin， florfenicol， polymixin B， neomycin， gentamycin， ofloxacin， norfloxacin， enrofloxacin， kanamycin， sulfisoxazole， streptomycin， trimethoprim， moderate susceptibility to roxithromycin and resistant（insensitivity） to doxycycline， nalidixic acid， amoxicillin， tetracycline and pipemidic acid. In addition， compared with healthy E. sinensis， the hepatopancreas and intestinal tract of diseased E. sinensis had obvious pathological change. The hepatopancreas cells of diseased E. sinensis were irregular-arranged， appeared local necrosis with pyknotic nucleus， local epithelial tissues of intestinal mucosa were dissolved and fell off into the intestinal cavity. 【Conclusion】A. veronii has high pathogenicity for E. sinensis which induces the body damages and even death by causing pathological changes in hepatopancreas and intestine， fishery quinolones， aminoglycosides， sulfonamides and amphenicols antibiotics can be used as a reference for the control of this disease.

Key words： Aeromonas veronii; Eriocheir sinensis; isolation and identification; antibiotic susceptibility; histopa-thological characterization

0 引言

【研究意義】中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）是我国重要的特种水产养殖品种，年产量已超过81万t（农业部渔业渔政管理局，2017），具有很高的养殖经济效益，但随着养殖密度和规模的不断扩大，细菌性病害对中华绒螯蟹养殖产生了严重危害，且呈现出病原菌种类多、繁殖速度快、致病力强和发病率高的特点，通常引起中华绒螯蟹内脏组织出现不同程度的损伤而导致大规模死亡（徐欣等，2003）。因此，加强细菌性病害研究对促进中华绒螯蟹养殖业健康发展具有重要意义。【前人研究进展】维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）是一种对水产养殖危害极大的致病菌，可导致斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）（黄小丽等，2010）、齐口裂腹鱼（Schizothorax prenanti）（谢光美等，2015）、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）（王兴丽等，2016）、中华鲟（Acipenser sinensis）（田甜等，2017）、凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）（张小明等，2017）、草鱼（Ctenopharyngodon idellus）（高彩霞等，2018）、达氏鲟（Acipenser dabryanus）（刘亚等，2018）、克氏原螯虾（Procambarus clarkia）（彭博文等，2018）、台湾泥鳅（Paramisgurnus dabryanus spp. Taiwan）（徐先栋等，2018）、鲫（Carassius auratus）（朱潜等，2018）和泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）（袁雪梅等，2018）等多种水产养殖动物发生严重病害，给水产养殖业带来巨大经济损失。目前，国内外有关水产动物维氏气单胞菌的流行特点、临床特征、分类地位、耐药性、致病机理及免疫防控等方面已有较多研究报道（康雪微等，2017;高彩霞等，2018;康元环等，2018;Song et al.，2018;Li et al.，2019），但其病理诊断基础较薄弱，仅系统阐明斑点叉尾鮰（黄小丽等，2010）、齐口裂腹鱼（谢光美等，2015）、虹鳟（王兴丽等，2016）和达氏鲟（刘亚等，2018）等少数水产动物维氏气单胞菌病的组织病理特征，尤其随着渔用抗生素的不合理使用，水产动物致病性维氏气单胞菌的耐药性日益增强，在一定程度上严重影响了水产动物维氏气单胞菌病的防控效果。【本研究切入点】2018年8月江苏省连云港市某养殖场的中华绒螯蟹出现严重病情，其临床特征主要表现为病蟹行动迟缓，摄食减少或不摄食，肝胰腺呈暗黄色，肠道有脓状黏液，与已报道的中华绒螯蟹维氏气单胞菌病病症（房海等，2008;郑世雄，2013;姜光明等，2016）不完全相同，因此急需鉴定其病原并科学用药以减少经济损失。【拟解决的关键问题】通过对患病中华绒螯蟹进行病原菌分离鉴定、毒力检测及药敏试验，并观察其组织病理特征，以期为该病的临床诊断和药物防控提供科学依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

自然发病中华绒螯蟹取自江苏省连云港市某养殖场，共16只，平均体重114.6 g/只;健康中华绒螯蟹由上海市某养殖场提供，共200只，大小均匀、体质健壮，平均体重20.1 g/只。API ID32E细菌生化鉴定试剂条（法国梅里埃公司产）和药敏纸片（杭州滨河微生物试剂有限公司产）购自上海傲之珊实业发展有限公司。

1. 2 病原菌分离

参照曹海鹏等（2015）的方法，对自然发病中华绒螯蟹进行病原菌的分离与纯化，并观察分离菌株培养获得的菌落形态特征及菌体形态。

1. 3 人工回归感染试验

人工回归试验设5个试验组和1个对照组，每组10只健康中华绒螯蟹。试验前参照曹海鹏等（2015）的方法制备分离菌株菌悬液，其中，试验组中华绒螯蟹分别在第三步足基部注射1.0×107 CFU/mL的菌悬液（徐海圣等，2002），注射剂量0.1 mL/只;对照组中华绒螯蟹注射等量无菌生理盐水。试验周期为7 d，养殖水温控制在28 ℃，每天观察中华绒螯蟹的病症及记录其死亡数量，并及时捞出死蟹再次进行病原菌分离，确定其致病性。

1. 4 病原菌鉴定

采用API ID32E细菌生化鉴定试剂条对病原菌株进行生理生化鉴定（李莉等，2015），并对分离菌株进行16S rRNA序列PCR扩增及测序分析（房海等，2008），最后采用邻接法构建系统发育进化树，通过16S rRNA序列分析对分离菌株进行分子鉴定。

1. 5 病原菌毒力测定

试验设4个试验组和1个对照组，每组10只健康中华绒螯蟹。试验组中华绒螯蟹分别在第三步足基部注射8.7×103～8.7×106 CFU/mL的分离菌株菌悬液（徐海圣等，2002），注射剂量0.1 mL/只;对照组中华绒螯蟹注射等量无菌生理盐水。试验周期为7 d，养殖水温控制在28 ℃，每天观察中华绒螯蟹的病症及记录其死亡数量，及时捞出死蟹再次进行病原菌分离鉴定，并依据概率单位图解法测定分离菌株对中华绒螯蟹的半数致死剂量（LD50）。

1. 6 病原菌药敏特性测定

采用纸片扩散法测定分离菌株的药敏特性（Joseph et al.，2011），并根据杭州滨河微生物试剂有限公司的《纸片法药敏试验抑菌圈直径判断标准》判定分离菌株对各抗生素的敏感度。

1. 7 组织病理观察

取患病中华绒螯蟹的肝胰腺和肠道等病灶组织，以健康中华绒螯蟹的相应组织为对照，通过常规病理组织学方法（杨宗英等，2018）制备石蜡组织切片，经HE染色后于光学显微镜下进行观察比较。

2 结果与分析

2. 1 病原菌分离结果

从患病中华绒螯蟹的肝胰腺中共分离获得5株疑似病原菌株，暂命名为HXH1、HXH2、HXH3、HXH4和HXH5。人工回归感染试验结果表明，仅HXH1菌株感染中华绒螯蟹后出现死亡，累计死亡率达100%（表1），其临床症状与自然发病中华绒螯蟹的病症（图1）基本一致，且从人工感染发病中华绒螯蟹肝胰腺中可再次分离到与HXH1菌株生理生化特性一致的菌株，由此判定HXH1菌株是引起中华绒螯蟹发病的病原菌。HXH1菌株在营养琼脂培养基上形成的菌落呈圆形，边缘整齐，表面光滑，米白色，中央略微隆起，不透明，革兰氏染色呈阴性，菌体呈杆状（图2）。

2. 2 病原菌鉴定结果

由表2可知，HXH1菌株的生理生化鉴定结果与维氏气单胞菌（A. veronii）对照菌株（高彩霞等，2018;袁雪梅等，2018）的生理生化特征基本一致。通过BLASTn对HXH1菌株与GenBank中已知菌株的16S rRNA序列进行同源性比对分析，结果发现HXH1菌株的16S rRNA序列（GenBank登錄号MK033596）与GenBank中已公布维氏气单胞菌代表菌株的16S rRNA序列自然聚类，其同源性为99%～100%（表3）。此外，基于菌株16S rRNA序列构建的系统发育进化树（图3）也显示，HXH1菌株与维氏气单胞菌HL-7株（GenBank登录号KF413417）的亲缘关系最近。综合生理生化鉴定结果及16S rRNA序列分析结果，可判定HXH1菌株为维氏气单胞菌（A. veronii）。

2. 3 病原菌毒力测定结果

将HXH1菌株配制成8.7×103～8.7×106 CFU/mL的菌悬液，然后分别注射感染健康中华绒螯蟹，至试验第7 d中华绒螯蟹的累计死亡率为20%～100%（表4），而注射无菌生理盐水的中华绒螯蟹未出现任何病症和死亡现象，从人工感染发病死亡中华绒螯蟹的肝胰腺内可分离获得与HXH1菌株生理生化特征一致的菌株，说明试验中华绒螯蟹的发病死亡为HXH1菌株感染所致。根据概率单位图解法建立的死亡概率（y）与菌悬液浓度对数（x）关系曲线方程为y=0.8416x+0.9269（R2=0.9707），即HXH1菌株对健康中华绒螯蟹的LD50为6.92×104 CFU/mL。

2. 4 病原菌的药敏特性

HXH1菌株对20种抗生素的药敏试验结果（表5）表明，HXH1菌株对复方新诺明、杆菌肽、奈替米星、氟苯尼考、多粘菌素B、新霉素、庆大霉素、氧氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、卡那霉素、磺胺异噁唑、链霉素和甲氧嘧啶等14种抗生素高度敏感，对罗红霉素中度敏感，对多西环素、萘啶酸、阿莫西林、四环素和吡哌酸等5种抗生素已产生耐药性（不敏感），与维氏气单胞菌代表菌株（房海等，2008;高彩霞等，2018;彭博文等，2018;袁雪梅等，2018）对复方新诺明、氟苯尼考、多粘菌素B、新霉素、庆大霉素、氧氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、卡那霉素、磺胺异噁唑、链霉素、甲氧嘧啶和阿莫西林等抗生素的敏感性一致。

2. 5 患病中华绒螯蟹的组织病理特征

与健康中华绒螯蟹相比，患病中华绒螯蟹的肝胰腺和肠道存在明显病理变化，具体表现为：患病中华绒螯蟹肝胰腺细胞排列极其紊乱，局部可见坏死细胞，细胞核固缩深染（图4）;局部肠黏膜上皮组织溶解脱落至肠腔内（图5）。

3 讨论

维氏气单胞菌隶属于气单胞菌科（Aeromonadaceae）气单胞菌属（Aeromonas），广泛分布于水体、淤泥和水生生物体内，是一种人—畜—水生动物共患致病菌（宋明芳等，2018），具有强致病性，但其感染中华绒螯蟹后的临床症状各不相同，有的表现为腹腔内有积水、鳃呈暗灰色、肝胰腺呈浅黄色（房海等，2008），有的表现为软壳、黑鳃、腹腔内有积水、肠内无食（郑世雄，2013），有的表现为鳃丝排列不整齐、肝胰腺淡黄、肠内无食、血液凝固缓慢或不凝固（姜光明等，2016），而本研究中的患病中华绒螯蟹表现为病蟹行动迟缓，摄食减少或不摄食，肝胰腺呈暗黄色，肠道有脓状黏液。因此，明确中华绒螯蟹维氏气单胞菌病的病理特征对提高其防控水平具有重要意义。

维氏气单胞菌不同菌株间通常存在明显的毒力差异。徐洋等（2015）分离获得的黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）致病性维氏气单胞菌H0426株的LD50为3.98×104 CFU/mL，张小明等（2017）分离获得的凡纳滨对虾致病性维氏气单胞菌AVZ01株的LD50为8.7×105 CFU/mL，康雪微等（2017）分离出的金鱼（Carassius auratus）致病性维氏气单胞菌KL-1株的LD50为1.4×107 CFU/mL，而本研究分离自中华绒螯蟹的维氏气单胞菌HXH1菌株的LD50为6.92×104 CFU/mL，其毒力明显高于维氏气单胞菌AVZ01和KL-1株。据报道，维氏气单胞菌的致病性通常与其气溶素、溶血素、肠毒素、酪蛋白酶、酯酶、淀粉酶和卵磷脂酶等相关毒力因子的分泌及表达密切相关（宋明芳等，2018），即维氏气单胞菌不同菌株间的毒力差异可能与其携带的毒力因子种类和数量不同有关。此外，不同来源的维氏气单胞菌还存在理化特性差异，如加州鲈（Micropterus salmoides）源致病性维氏气单胞菌（龙波等，2016）和泥鳅源致病性维氏气单胞菌（袁雪梅等，2018）表现出不同的纤维二糖发酵特性，可能与维氏气单胞菌不同菌株所处的地理差异或生长环境不同有关（李小波和黄文芳，2003）。因此，维氏气单胞菌的鉴定方法通常需在生理生化鉴定的基础上进行16S rRNA序列分析鉴定（李莉等，2015）。本研究综合生理生化鉴定与16S rRNA序列分析结果，确定引起江苏省连云港市某养殖场中华绒螯蟹发病死亡的病原菌（HXH1菌株）为维氏气单胞菌。

肝胰腺不同程度坏死是中华绒螯蟹维氏气单胞菌病的常见病症（房海等，2008;姜光明等，2016）。已有研究表明，引起中华绒螯蟹肝胰腺坏死的病因可分为细菌性（孙修云和宫子慧，2017）和非生物性（陆宏达等，2017）两种类型。陆宏达等（2017）、杨宗英等（2018）研究认为，中华绒螯蟹非生物性肝胰腺坏死是以肝胰腺出现水肿或萎缩为主要病理特征，且随着病情的加重，肝胰腺组织中单层上皮细胞空泡化严重，肝胰腺细胞排列紊乱，肝胰腺细胞坏死、细胞核固缩、胞质崩解。至今，有关中华绒螯蟹细菌性肝胰腺坏死的组织病理特征鲜见报道。本研究对维氏气单胞菌引起的中华绒螯蟹病理组织进行观察，发现患病中华绒螯蟹的肝胰腺细胞排列极其紊乱，局部可见坏死细胞，细胞核固缩深染，但与中华绒螯蟹非生物性肝胰腺坏死不同的是肝胰腺并未出现明显的水肿或萎缩等病理特征。因此，通过检测肝胰腺是否出现明显的水肿或萎缩等病理症状，可有效区分中华绒螯蟹非生物性肝胰腺坏死和细菌性肝胰腺坏死。

近年来，虽然基于中药和益生菌等新型抗生素替代品的疾病防控技术研究已取得显著进展，但由于这些抗生素替代品存在应用效果不稳定、成本较高及基础理论研究不完善等问题（王熙涛等，2015），因此科学选择和使用抗生素仍是细菌性疾病防控的主要手段。本研究的藥敏试验结果表明，HXH1菌株对恩诺沙星、新霉素、氟苯尼考和磺胺异噁唑等渔用抗生素高度敏感，可作为临床用药的依据。此外，HXH1菌株与房海等（2008）分离获得的中华绒螯蟹源维氏气单胞菌对复方新诺明、氟苯尼考、多粘菌素B、新霉素、庆大霉素、氧氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星和卡那霉素等抗生素均高度敏感，但对杆菌肽、多西环素和四环素等抗生素的敏感特性存在明显差异，与姜光明等（2016）分离获得的中华绒螯蟹源维氏气单胞菌对磺胺类抗生素的敏感特性也有差异，说明中华绒螯蟹源维氏气单胞菌不同菌株间也存在药敏特性差异。因此，养殖生产中对中华绒螯蟹维氏气单胞菌病进行药物防控时必须有针对性地进行药敏筛选试验，选择最有效的药物以减轻病原菌的耐药性，提高病害的防控效果。

4 结论

维氏气单胞菌对中华绒螯蟹具有较强的致病性，通过引起肝胰腺和肠道等器官组织的病理变化而造成机体损伤甚至死亡，养殖生产上可选用喹诺酮类、氨基糖苷类、磺胺类和酰胺醇类渔用抗生素进行防治。

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（責任编辑 兰宗宝）