响应面法优化白首乌C21甾苷热回流提取工艺

许慧卿 冯进 李春阳 顾闽峰 吴承东 张明 张道国

摘要：【目的】通過响应面法优化白首乌中C21甾苷的热回流提取工艺条件，为促进白首乌C21甾苷在食品工业中的开发利用提供参考依据。【方法】以2年生滨乌一号为原料，通过单因素试验考察乙醇体积分数、料液比、提取温度和提取时间等4个因素对白首乌C21甾苷提取量的影响;利用响应面试验设计，采用4因素3水平分析法对白首乌C21甾苷热回流提取工艺进行优化。【结果】建立了白首乌C21甾苷提取量（Y）与乙醇体积分数（A）、料液比（B）、提取温度（C）和提取时间（D）间的二次多元回归方程： Y=22.76+0.81A+0.85B+1.10C+1.44D+0.32AB–0.18AC+0.11AD+0.94BC+0.66BD+0.57CD–1.14A2–2.00B2–1.98C2–1.59D2。各因素对白首乌C21甾苷提取量影响效果的排序为提取时间>提取温度>料液比>乙醇体积分数，4个因素及料液比与提取温度、料液比与提取时间、提取温度与提取时间的交互作用对白首乌C21甾苷提取量的影响显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）。热回流提取白首乌C21甾苷的最佳工艺条件为：乙醇体积分数90%、料液比1∶17（g/mL）、提取温度80 ℃、提取时间2.5 h，在此条件下，白首乌C21甾苷提取量为23.56±0.432 mg/g，与预测值（23.79 mg/g）接近。【结论】响应面优化的热回流提取工艺可有效提取白首乌C21甾苷，建立的回归模型可用于实际生产预测。

关键词： 白首乌;C21甾苷;热回流提取;单因素;响应面法;工艺优化

中图分类号： S567.79                            文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）06-1304-08

Abstract：【Objective】The thermal circumfluence extraction parameters of C21 steroidal glycosides in Cynanchum auriculatum Royle ex Wight were optimized in this work by response surface methodology to promote their development and utilization in the food industry. 【Method】Biennial C. auriculatum Bingwuyihao was subjected to C21 steroidal glycosides extraction in this work， and the effects of extraction parameters， such as ethanol volume fraction， solid-to-liquid ratio， extraction temperature and extraction time， on the yield of C21 steroidal glycosides were investigated by single-factor tests. Thereafter， a response surface experiment with four factors and three levels was utilized to optimize the extraction process of C21 steroidal glycosides from C. auriculatum. 【Result】A quadratic multiple regression equation between the extraction yield of C21 steroidal glycosides（Y） and ethanol volume fraction（A）， the solid-to-liquid ratio（B）， extraction temperature （C） and extraction time（D） was established：Y=22.76+0.81A+0.85B+1.10C+1.44D+0.32AB–0.18AC+0.11AD+0.94BC+0.66BD+0.57CD–1.14A2–2.00B2–1.98C2–1.59D2. The order of factors affecting C21 steroidal glycosides yield was as fo-llow：extraction time>extraction temperature>solid-to-liquid ratio>ethanol volume fraction. The effects of various factors and interaction between solid-to-liquid ratio and extraction temperature，between solid-to-liquid ratio and extraction time，between extraction temperature and extraction time on the C21 steroidal glycosides yield were significant（P<0.05） or extremely significant（P<0.01）. The optimal parameters were as follows：ethanol volume fraction 90%， solid-to-liquid ratio 1∶17（g/mL）， extraction temperature 80 ℃， and extraction time 2.5 h. C21 steroidal glycosides yield of 23.56±0.432 mg/g was obtained under the optimized condition， which was consistent with the predicted value（23.79 mg/g）. 【Conclusion】 Optimization of the thermal circumfluence extraction by response surface methodology can effectively extract the C21 steroidal glycosides from C. auriculatum. The established regression model can be used for actual production forecasts.

Key words：Cynanchum auriculatum Royle ex Wight; C21 steroidal glycosides; thermal circumfluence extraction; single factor; response surface methodology; process optimization

收稿日期：2018-10-23

作者简介：*为通讯作者，李春阳（1966-），博士，研究员，主要从事食品营养化学及农产品精深加工技术研究工作，E-mail：lichunyang968@126.com。许慧卿（1994-），研究方向为功能食品与活性物质，E-mail：2017808092@njau.edu.cn

0 引言

【研究意义】滨海白首乌又名耳叶牛皮消（Cynanchum auriculatum Royle ex Wight），为萝藦科鹅绒藤属植物，是滨海的特色植物资源（张晓玲等，2006;陈亚等，2013）。滨海白首乌味甘、苦，性微温，含有蛋白质、淀粉、磷脂、游离氨基酸等多种营养成分（Sun et al.，2013;孙彦敏等，2015;方希修等，2016），并含有C21甾苷、多糖、苯酮等生物活性物质（赵雪，2017;Qin et al.，2018）。药理研究证实，白首乌具有抗氧化（宋俊梅等，2001）、护肝（尹家乐等，2007）、抗炎（张士侠等，2007a）、延缓衰老（张士侠等，2007b）、免疫调节（曾郁敏等，2009）及抗肿瘤（陈蒋丽等，2015）等功效。C21甾苷是目前白首乌中发现的最主要生物活性成分，但其在食品工业中的应用较少，提取工艺的相关研究也不多，因此，优化白首乌C21甾苷提取工艺，对促进其在食品领域中的开发利用具有重要意义。【前人研究进展】在白首乌C21甾苷结构和活性功能方面，Teng等（2011）从耳叶牛皮消中分离到Cyanoauriculoside A、B两种新的C21甾苷单体;Liu等（2013）从耳叶牛皮消中分离获得9种新型孕甾苷（Cyanoauriculoside A～Cyanoauriculoside I），并通过大鼠模型验证其具有抑制食欲作用;王冬艳等（2015）通过建立实验性高脂血症大鼠模型，发现白首乌C21甾苷具有较好的调节血脂和改善肝脏脂肪变性作用;Qian等（2017）从耳叶牛皮消中分离鉴定出23种C21甾体糖苷，并证实其可显著抑制H2O2引起的PC12细胞损伤。在白首乌C21甾苷提取方面，付文焕（2003）的研究结果表明热回流法对白首乌总苷的提取率高于渗漉法，通过正交试验优化得到最佳热回流提取工艺：10倍量95%乙醇回流提取3次，每次2 h;吕志敏等（2009）采用正交试验对白首乌中C21甾苷超临界CO2液体萃取工艺参数进行优化，确定萃取温度、原料粒度和夹带剂量对C21甾苷提取能力影响最大，得出最优萃取条件：萃取压力30 MPa、萃取时间90 min、萃取温度55 ℃、原料粉碎粒度40目、夹带剂量2.0 mL/g;宋康等（2010）对不同提取工艺下白首乌C21甾苷含量进行研究，确定常温浸提获得的C21甾苷含量最低，超声提取次之，热回流提取效果最佳;牟玲丽等（2011）以得率为考察指标，通过正交试验优化得到白首乌C21甾苷提取最佳工艺：6倍量90%乙醇提取3次，每次1 h。【本研究切入点】目前，研究者大多采用正交试验优化白首乌C21甾苷提取工艺，把乙醇体积分数、料液比、提取次数和提取时间作为单因素（付文焕，2003;牟玲丽等，2011），而将提取温度考虑在内，利用响应面试验模型优化热回流提取白首乌C21甾苷工艺的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】以2年生滨海白首乌为试验材料，在已有研究（付文焕，2003;牟玲丽等，2011;费洪荣等，2015）的基础上增加温度因素对白首乌C21甾苷提取量的影响，通过单因素试验和响应面法优化热回流提取白首乌C21甾苷的工艺条件，为扩大白首乌甾苷在功能食品领域的应用提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

2年生白首乌滨乌一号由盐城市新洋农业试验站提供，无水乙醇、正丁醇和香兰素等购自国药集团化学试剂有限公司，告达亭标准品购自上海源叶生物科技公司。主要仪器设备：Sigma 3K15离心机（德国Sigma公司）、万能高速粉碎机[欧凯莱芙（香港）宝业公司]、AL104型电子天平[梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司]、RE52-A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）和752型紫外可见分光光度计（上海棱光技术有限公司）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 告达亭标准曲线绘制 配制1 mg/mL告达亭标准溶液，分别吸取0.04、0.08、0.12、0.14、0.16、0.18和0.20 mL标准溶液置于磨口具塞试管中，挥干溶剂后，加入0.5 mL 8.0%香草醛无水乙醇溶液（现用现配）;然后在冰水浴中加入5.0 mL 77%硫酸溶液，充分混合后，置于70 ℃水浴中加热15 min，立即转入冰水浴中冷却15 min;室温条件下放置30 min后，使用紫外可见分光光度计测定混合溶液在478 nm处吸光值（付文焕，2003）。以告达亭质量浓度（x）对吸光值（y）进行线性回归分析，得到回归方程y=0.0173x+0.0292（R²=0.9991，线性范围3.636～36.364 μg/mL）。

1. 2. 2 白首乌C21甾苷提取及含量测定 将2年生白首乌用组织捣碎机粉碎，过60目筛后得到白首乌粉，于-20 ℃保存。准确称取白首乌粉末5.0 g，按料液比1∶12（g/mL，下同）加入80%乙醇溶液于圆底烧瓶中，采用热回流法，提取温度70 ℃，提取1.5 h;提取液经4500 r/min離心10 min并收集上清液，残渣二次提取离心后，将2次所得上清液合并，并减压浓缩至无醇味;将浓缩液补水至50.0 mL，用等体积的水饱和正丁醇萃取2次，收集正丁醇相并减压蒸干，然后用无水乙醇溶解并定容至25.0 mL，精密吸取0.1 mL乙醇溶液，水浴挥干后测定甾苷含量（费洪荣等，2015），结果以每克白首乌（干重）中含有的C21甾苷质量（告达亭当量）计，单位为mg/g。

1. 2. 3 单因素试验

1. 2. 3. 1 乙醇体积分数对白首乌C21甾苷提取量的影响 准确称取5份5.0 g白首乌粉末，分别加入60.0 mL不同体积分数（60%、70%、80%、90%和100%）的乙醇溶液，70 ℃下提取2 h，提取2次，测定C21甾苷提取量。

1. 2. 3. 2 料液比对白首乌C21甾苷提取量的影响 准确称取5份5.0 g白首乌粉末，分别按料液比1∶4、1∶8、1∶12、1∶16和1∶20加入80%乙醇溶液，70 ℃下提取2 h，提取2次，测定C21甾苷提取量。

1. 2. 3. 3 提取温度对白首乌C21甾苷提取量的影响 准确称取5份5.0 g白首乌粉末，加入60.0 mL 80%乙醇溶液，分别在30、45、60、75和90 ℃下提取2 h，提取2次，测定C21甾苷提取量。

1. 2. 3. 4 提取时间对白首乌C21甾苷提取量的影响 准确称取5份5.0 g白首乌粉末，加入60.0 mL 80%乙醇溶液， 70 ℃下分别提取1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h，提取2次，测定C21甾苷提取量。

1. 2. 4 响应面法优化白首乌C21甾苷提取工艺 选择乙醇体积分数、料液比、提取温度和提取时间为自变量，以白首乌C21甾苷提取量为考察指标，设计4因素3水平的响应面分析试验，各因素水平见表1。

1. 3 统计分析

试验进行3次重复。采用SAS 9.3分析处理试验数据，使用Design-Expert 8.0.6进行响应面分析，Origin 8.5作图。

2 结果与分析

2. 1 单因素对白首乌C21甾苷提取量的影响

2. 1. 1 乙醇体积分数对提取量的影响 乙醇体积分数与溶液的极性和穿透性密切相关，因此能影响C21甾苷的提取效率。从图1可看出，随着乙醇体积分数的增加，白首乌C21甾苷提取量变大，当乙醇体积分数达90%时，白首乌C21甾苷提取量达最大值（17.54 mg/g），之后继续增加乙醇体积分数，白首乌C21甾苷提取量略有下降。这可能是随着乙醇体积分数增加，溶液极性逐渐降低，溶剂的穿透力逐渐增强，达90%时，具有提取C21甾苷相对最合适的极性，使得提取量最大;随着乙醇体积分数进一步增加，一些醇溶性杂质、亲脂性强的成分溶出增多，进而减弱了溶剂对C21甾苷的提取效果。因此，最适乙醇体积分数为90%左右。

2. 1. 2 料液比对提取量的影响 原料浸提过程中扩散速度是决定提取效果的关键因素。扩散过程中扩散系数与浓度差呈正相关，确定料液比的实质是选择一个合适浓度差，从而得到好的提取效果。由图2可知，料液比在1∶4～1∶16时，提取量随料液比的减小而增大，料液比为1∶16的提取量达最大值（17.70 mg/g），此后继续减小料液比，提取量反而降低。分析原因可能是当料液比大于1∶16时，随着提取溶剂体积的增大，浓度差加大，增强了扩散作用的推动力，使得C21甾苷浸出物增多;小于1∶16时由于溶剂用量过大导致浓缩能耗增加和回收困难，使得C21甾苷提取量有所下降。因此，最适料液比为1∶16左右。

2. 1. 3 提取温度对提取量的影响 温度主要通过影响可溶性成分的溶解度和扩散速度从而影响C21甾苷提取量。C21甾苷对热稳定，理论上温度越高，扩散速度越快，可溶性成分的溶解度越高，C21甾苷浸出物会越多。由图3可知，在30～75 ℃范围内，C21甾苷提取量随着提取温度的升高而增加，在75 ℃左右提取量达最大值（17.82 mg/g），之后继续升高温度至90 ℃时，C21甾苷提取量不再增加。温度过高时，热不稳定成分或挥发性成分易分解或挥发，从而影响C21甾苷提取纯度。因此，最适温度在75 ℃左右。

2. 1. 4 提取时间对提取量的影响 由图4可知，当提取时间从1.0 h延长至2.5 h时，白首乌C21甾苷提取量由14.48 mg/g增加至17.56 mg/g，超过2.5 h后趋于平稳。分析原因，可能是扩散值随着提取时间的延长而增大，从而有利于浸提物析出，但提取时间越长，可溶性杂质溶出也越多，从而影响后续测定。所以在浸提完全的前提下，需要尽可能地缩短提取时间。因此，最适提取时间在2.5 h左右。

2. 2 响应面法优化结果

2. 2. 1 二次回归模型的建立 利用Design-Expert 8.0.6对响应面结果（表2）进行分析，并建立二次回归模型，拟合得到白首乌C21甾苷提取量与提取条件之间的二次多元回归方程： Y=22.76+0.81A+0.85B+1.10C+1.44D+0.32AB–0.18AC+0.11AD+0.94BC+0.66BD+0.57CD–1.14A2–2.00B2–1.98C2–1.59D2。

2. 2. 2 回归模型的显著性分析结果 由表3可知，回归模型P<0.0001，达极显著水平;失拟项P=0.7545>0.05，不具有显著性;R2=0.9733，R[2Adj]=0.9466，说明在97.33%的情况下，白首乌C21甾苷提取量随各因素的变化可由建立的模型进行准确预测。回归方程系数的方差分析表明，4个因素对白首乌C21甾苷提取量的影响排序为D（提取时间）>C（提取温度）>B（料液比）>A（乙醇体积分数）。由P 可知，除交互项AB、AC和AD对白首乌C21甾苷提取量的影响不显著（P>0.05，下同）外，其余项均达显著（P<0.05，下同）或极显著（P<0.01）水平。

2. 2. 3 两因素间交互作用分析 响应面试验结果利用Design-Expert 8.0.6进行分析后，得到乙醇体积分数、料液比、提取温度和提取时间4个因素间交互作用的响应面图（图5）。由图5-D、图5-E和图5-F响应面坡度较陡峭的趋势可知，料液比、提取温度和提取时间两两間的交互作用均对白首乌C21甾苷提取量有显著影响。分析原因可能是料液比影响浓度差，进而改变扩散速度;同样，提取温度的改变会影响扩散效果;而提取时间延长，扩散值会越大，浸提效果越好，三者相辅相成。反之，由图5-A、图5-B和图5-C的响应面趋势可知，乙醇体积分数与料液比、提取温度和提取时间的交互作用对白首乌C21甾苷提取量均不显著。响应面分析结果与回归模型的显著性分析结果一致，说明结果可靠有效。

2. 2. 4 试验结果验证 由建立的回归模型得到提取白首乌C21甾苷的最佳工艺参数：乙醇体积分数92.08%、料液比1∶16.85、提取温度83.39 ℃、提取时间2.76 h，在上述工艺条件下提取2次，白首乌C21甾苷提取量为23.79 mg/g。根据实际情况，各参数调整为：乙醇体积分数90%、料液比1∶17、提取温度80 ℃、提取时间2.5 h，在此条件下进行验证，测得白首乌C21甾苷提取量为23.56±0.432 mg/g，与预测值相差较小，表明建立的回归模型稳定性和预测准确性良好。

3 讨论

C21甾苷的提取方法通常有渗漉法和热回流法。由于渗漉法提取时间长、提取率低，因此目前主要采用热回流法。付文焕（2003）研究得出白首乌C21甾苷的最佳热回流提取工艺条件：95%乙醇、料液比1∶10、回流提取3次、每次2 h，在此条件下获得白首乌C21甾苷含量16.5 mg/g;费洪荣等（2015）以泰山白首乌为原料，通过正交试验优化得到最佳提取工艺条件为8倍量95%乙醇回流提取2次，每次1.5 h，在此条件下泰山白首乌C21甾苷含量约3 mg/g。白首乌中C21甾苷含量随栽培年限呈逐年升高趋势（张锋，2006），但栽培时间过长，也会造成栽培成本和栽培技术难度增加，故在本研究中，以2年生滨海白首乌为原料，并在前人研究（付文焕，2003;牟玲丽等，2011;费洪荣等，2015）基础上考虑提取温度对白首乌C21甾苷提取量的影响。通过单因素试验发现，随着提取温度升高，物质扩散速度加快，可溶性成分的溶解度升高，白首乌C21甾苷浸出物逐渐增加;但提取温度过高时，热不稳定成分或挥发性成分易分解或挥发，从而影响提取出的白首乌C21甾苷纯度，故将提取白首乌C21甾苷的适宜温度范围确定在70～90 ℃。然后通过设计响应面试验模型，得出最优工艺水平：乙醇体积分数90%、料液比1∶17、提取温度80 ℃、提取时间2.5 h，在此工艺下，测得白首乌C21甾苷含量为23.56±0.432 mg/g，与预测值相差较小。可见，由响应面优化得到的白首乌C21甾苷提取参数稳定可靠。本研究获得的白首乌C21甾苷提取量略高于付文焕（2003）的研究结果，究其原因，虽然研究材料均为滨海白首乌，但本研究的样品为2年生白首乌，C21甾苷积累较1年生增多;且把提取温度因素考虑在内，提高了乙醇提取效果和C21甾苷的浸出率。相对于费洪荣等（2015）的研究结果差别明显，可能是泰山白首乌中C21甾苷含量較少，或其采用的高氯酸比色法灵敏度不够高导致检测含量偏低。

现有研究大多通过正交试验优化白首乌C21甾苷提取工艺（付文焕，2003;费洪荣等，2015），但无法确定影响因素的最佳组合和响应值的最优值，不能提供各影响因素的交互作用。本研究通过响应面分析，既克服了正交试验的局限性，得到单因素及两两因素间交互作用对白首乌C21甾苷提取量的影响，又能确保试验值与理论值相差较小。4个因素及料液比与提取温度、料液比与提取时间、提取温度与提取时间的交互作用对白首乌C21甾苷提取量的影响显著，各因素对白首乌C21甾苷提取量影响效果的排序为提取时间>提取温度>料液比>乙醇体积分数，印证了将提取温度这一因素考虑在内的重要性。本研究优化的白首乌C21甾苷提取工艺，为实现白首乌C21甾苷在食品工业中的开发利用提供了理论参考。

4 结论

通过响应面试验优化的热回流提取工艺（乙醇体积分数90%、料液比1∶17、提取温度80 ℃、提取时间2.5 h）可有效提取白首乌C21甾苷，建立的回归模型可用于实际生产预测。

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（责任编辑 罗 丽）