鸡胚成纤维细胞cDNA文库构建及其与禽呼肠孤病毒σA相互作用宿主蛋白的筛选

叶丽娜 谢芝勋 谢丽基 王盛 邓显文 谢志勤 范晴 黄娇玲 曾婷婷 张艳芳 罗思思

摘要：【目的】構建鸡胚成纤维细胞（CEF）的cDNA文库并筛选与禽呼肠孤病毒（ARV）σA蛋白相互作用的宿主蛋白，为揭示互作蛋白对ARV复制及凋亡的分子调控机制打下基础。【方法】采用TRIzol法提取CEF细胞总RNA，以SMART技术和LD-PCR合成双链cDNA（ds cDNA），ds cDNA和pGADT7-Rec共转化Y187酵母感受态细胞，构建cDNA文库;将pGBKT7-σA诱饵质粒转至Y2HGold酵母感受态细胞中，并与构建的cDNA文库进行酵母双杂交筛选，筛选出的候选文库菌经质粒提取后与pGBKT7-σA诱饵质粒再共转化Y2HGold酵母菌，筛选出能在SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba固体培养基上生长且明显变蓝的菌落，最后提取蓝色酵母菌质粒进行测序分析。【结果】构建的CEF细胞cDNA文库库容为1.6×106 CFU，文库滴度为3.1×108 CFU/mL，插入片段大小集中在300～2000 bp，重组率为91.67%。以含有pGBKT7-σA的Y2HGold酵母菌与cDNA文库酵母菌进行双杂交，阳性克隆能在SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba（SD/-4/X/A）固体培养基上长出菌落且明显变蓝，测序结果显示共筛选出4个能与σA蛋白相互作用的宿主蛋白，分别是初期多肽相关复合体α亚基（NACA）、核苷二磷酸激酶2（NME2）、假定蛋白及线粒体核糖体蛋白S9（MRPS9）。【结论】通过SMART技术构建的CEF细胞cDNA文库具有较好的库容和滴度，且从cDNA文库中筛选出4种与ARV σA蛋白相互作用的宿主蛋白，为后续研究互作蛋白对ARV复制及凋亡的分子调控机制提供了可靠数据。

关键词： 禽呼肠孤病毒;σA蛋白;cDNA文库;互作蛋白;酵母双杂交

中图分类号： S852.657                         文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）06-1362-07

Abstract：【Objective】Construction of a cDNA library of chicken embryo fibroblasts（CEF） and screening for host proteins interacting with avian reovirus σA protein were conducted to lay a foundation for revealing the molecular regulation mechanism of interaction protein on ARV replication and apoptosis. 【Method】Extraction of CEF total RNA using TRIzol method was carried out， and double-strands cDNA（ds cDNA） was synthesized by SMART and LD-PCR technique. Co-transformation of ds cDNA with linearized pGADT7-Rec in competent Y187 yeast cells was realized， then cDNA library was established. The bait plasmid pGBKT7-σA was transformed into Y2HGold yeast competent cells，and yeast two-hybrid screening was conducted with the established cDNA library. The selected candidate library strain was extracted by plasmid， then co-transformed with bait plasmid pGBKT7-σAinto Y2HGold yeast cells. The colonies that grew well and could turn blue in solid media containing SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba were selected，then blue yeast plasmid was extracted for sequencing analysis. 【Result】The capacity of CEF cell cDNA library was 1.6×106 CFU， titer was 3.1×108 CFU/mL，the insert size was between 300 bp and 2000 bp， recombination rate was about 91.67%. Two-hybridization was carried out with Y2HGold yeast strain containing pGBKT7-σA and cDNA library yeast strain， and the po-sitive clone was able to grow colonieson the SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba（SD/-4/X/A） solid media and appeared blue. The sequencing results showed that four host proteins interacting with σA protein were screened， which were the initial polypeptide-related complex α subunit（NACA）， nucleoside diphosphate kinase 2（NME2）， putative protein and mitochondrial ribosomal protein S9（MRPS9）， respectively. 【Conclusion】The constructed CEF cDNA library by SMART technique has a good capacity and titer， and four host proteins interacting with ARV σA protein are screened from the cDNA library for further study of the molecular mechanisms interacting with ARV replication and apoptosis.

Key words： avian reovirus; σA protein; cDNA library; interacting proteion; yeast two-hybrid

收稿日期：2018-06-29

作者简介：*为通讯作者，谢芝勋（1963-），研究员，主要从事动物传染病防控技术研究工作，E-mail：xiezhixun@126.com。叶丽娜（1989-），主要从事动物传染病分子生物学研究工作，E-mail：931997686@qq.com

0 引言

【研究意义】禽呼肠孤病毒（Avian reovirus，ARV）是家禽中普遍存在且具有免疫抑制作用的一种病毒，主要引起鸡病毒性关节炎、矮小综合征和呼吸道疾病等（韦平和秦爱建，2008;谢志勤等，2012），导致感染后的雏鸡免疫器官发育不良（张昆丽等，2015a，2015b），对养禽业危害严重。σA蛋白为ARV的结构蛋白，主要构成其核衣壳，与病毒拮抗干扰素作用有关（González-López et al.，2003），通过降低感染鸡群的免疫应答能力而引起免疫抑制。σA蛋白还能激活PI3K/Akt信号通路，有利于ARV在宿主细胞内感染复制（谢丽基等，2015）。此外，Yin等（2002）研究发现σA蛋白可将4种三磷酸核苷（NTP）水解成二磷酸核苷（NDP）或核苷酸（NMP）及游离磷酸，为病毒的复制和转录提供能量;Chiu等（2016）研究发现σA蛋白能进入宿主细胞核内，与细胞核内蛋白发生结合;但至今尚未明确σA蛋白是与宿主细胞中的何种蛋白发生相互作用而最终诱导一系列生物学下游反应。鉴于鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblasts，CEF）对ARV的易感性，且易于制备，通常将CEF细胞作为研究ARV的细胞模型（张昆丽等，2015a，2015b），因此，以CEF细胞为宿主细胞模型构建cDNA文库，并筛选与σA蛋白相互作用的宿主蛋白，对揭示σA蛋白的作用机理具有重要意义。【前人研究进展】CEF细胞来源方便、制备简单，且表面有许多病毒受体，使其可成为很多病毒的体外宿主细胞，如研究马立克氏病毒（MDV）、鸡传染性法氏囊病毒（IBDV）和鸡新城疫病毒（NDV）等常见动物病毒时均首选CEF细胞作为宿主细胞（王友等，2013）。刘伟等（2007）运用Gateway技术对CEF细胞mRNA进行分离纯化并反转录后连接Adapter，经BP重组反应及LR重组反应后成功构建获得CEF细胞表达文库，文库库容为5.5×106 CFU，文库滴度為5×105 CFU/mL，为下一步研究IBDV致病机制打下基础。张改平等（2008）也成功构建了CEF细胞cDNA文库，其库容为8.8×105 CFU，可用于CEF细胞相关功能蛋白的研究。赵绪永等（2008）成功构建了CEF细胞的cDNA T7噬菌体表达文库，为筛选和研究CEF细胞上的病毒受体分子奠定了基础。段志强等（2011）运用SMART技术和LD-PCR将CEF细胞总RNA反转录合成双链cDNA（ds cDNA）后转化AH109酵母感受态细胞，成功构建获得CEF细胞的cDNA文库，文库库容为3×106 CFU。祁小乐等（2013）运用SMART技术成功构建了CEF细胞cDNA文库，文库滴度为6.94×107 CFU/mL，并证实该cDNA文库可用于研究IBDV和NDV等禽病病毒与宿主蛋白的相互作用。此外，王建琳等（2017）利用CEF细胞研究NDV诱导鸡TLR和Mx基因mRNA转录水平，以期为揭示不同毒力NDV诱导IFN-I产生差异的作用机制提供参考依据;刘炜玮（2018）利用CEF细胞研究了NDV的复制机制及其与宿主的相互作用;王静等（2018）利用CEF细胞揭示禽网状内皮组织增生症病毒（REV）感染宿主的致瘤及免疫抑制机制。【本研究切入点】CEF细胞是研究病原体蛋白与宿主蛋白相互作用的首选宿主细胞，在NDV、IBDV等禽病病毒上已取得成功（李铁强，2008;朱礼倩，2008;刘炜玮，2018），但目前鲜见利用CEF细胞筛选与ARV σA蛋白相互作用宿主蛋白的研究报道。【拟解决的关键问题】通过SMART技术构建CEF细胞cDNA文库，并采用酵母双杂交技术筛选出与ARV σA相互作用的宿主蛋白，为揭示互作蛋白对ARV复制及凋亡的分子调控机制打下基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

10日龄SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司;氨苄青霉素（Amp+）、RNA提取试剂盒RNAiso Plus、Premix Ex Taq和RNA Loading Bu-ffer购自TaKaRa公司;质粒提取试剂盒购自美国Axygen公司;cDNA文库构建试剂盒、酵母菌质粒提取试剂盒、Aureobasidin A（Aba）、X-α-gal及SD/Trp、SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His（SD/-4）等各种酵母培养基购自Clontech公司，其中Y187、Y2HGold、pGADT7-Rec和Carrier DNA为文库构建试剂盒自带;参照卢恒等（2017）的方法构建pGBKTA-σA诱饵质粒;cDNA文库鉴定引物T7（5'-TAATACGACTCA CTATAGGGC-3'）和3'AD（5'-AGATGGTGCACGAT GCACAG-3'）由深圳华大基因股份有限公司合成。

1. 2 CEF细胞制备

取10日龄SPF鸡胚按常规方法制备CEF细胞（韦平和秦爱建，2008），置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养21 h后提取细胞总RNA。

1. 3 CEF细胞总RNA提取及cDNA第一链合成

按照RNAiso Plus试剂盒说明提取细胞总RNA，然后用40.0 μL无RNA酶水溶解，紫外分光光度计测定总RNA浓度及OD260/OD280，取5.0 μL RNA并加入等体积RNA Loading Buffer，65 ℃作用10 min后以1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测分析。按照cDNA文库构建试剂盒说明合成cDNA第一链。

1. 4 ds cDNA扩增及纯化

采用LD-PCR将cDNA第一链合成ds cDNA，反应体系和扩增程序按照试剂盒说明进行操作，选择扩增24个循环。扩增结束后取7.0 μL LD-PCR产物，以1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，剩余LD-PCR产物经CHROMA SPIN TE-400柱进行纯化。

1. 5 Y187酵母感受态细胞制备

挑取30 ℃培养3 d的Y187酵母单菌落，接种于20.0 mL的YPDA液体培养基中，30 ℃振荡培养至OD600>1.5（约24 h），取菌液接种至100.0 mL新的YPDA液体培养基中，使菌液OD600为0.2～0.3，继续培养至OD600为0.4～0.6（4～5 h）。取100.0 mL菌液700×g离心5 min后用30.0 mL无菌去离子水重悬，700×g再离心5 min，用1.5 mL 1.1×TE/LiAC重悬菌体，12000 r/min离心15 s，再用600.0 μL 1.1×TE/LiAC重悬菌体，此菌体即为Y187酵母感受态细胞。

1. 6 ds cDNA和pGADT7-Rec共转化Y187酵母菌

取3 μg ds cDNA、6.0 μL pGADT7-Rec（0.5 μg/ μL）和20.0 μL Carrier DNA（经热变性处理），混均后加入到600.0 μL冰浴的Y187酵母感受态细胞中，用15.0 mL 0.9% NaCl重悬菌体。取少量菌液，分别按1∶10和1∶100倍稀释，两个稀释度的菌液各取100.0 μL涂布于100 mm的SD/-Leu培养基上，用于计算cDNA文库库容。剩余菌液涂布于100个150 mm的SD/-Leu培养基上，30 ℃培养3～5 d。

1. 7 文库收集及滴度测定

将1.6中长出菌落的SD/-Leu培养基置于4 ℃冰箱中预冷4 h，用冻存液（含25%甘油的YPDA）和玻璃珠将培养基上的菌落洗下并收集，离心后将细菌浓度调至大于2×107 CFU/mL。取少量cDNA文库进行102、104和106倍稀释，取100.0 μL稀释后的菌液分别涂布于100 mm SD/-Leu培养基上，30 ℃培养3 d后进行菌落计数并计算文库滴度。文库滴度（CFU/mL）=培养基菌落数/（涂板体积×稀释倍数）。

1. 8 文库插入片段鉴定

在SD/-Leu培养基上随机挑取24个单菌落，加200.0 μL PBS懸浮菌体，水浴锅中煮沸10 min后进行菌落PCR鉴定。采用pGADT7-Rec序列上的T7和3'AD引物扩增目的片段，PCR反应体系：Premix Ex Taq 12.5 μL，T7和3'AD引物（10 μmol/L）各1.0 μL，菌液1.0 μL，无菌去离子水9.5 μL。扩增程序：95 ℃预变性3 min;95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，进行34个循环;72 ℃延伸5 min。PCR产物以1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测，鉴定文库插入片段大小。

1. 9 诱饵菌株与文库杂交

将pGBKTA-σA诱饵质粒转至Y2HGold酵母感受态细胞中，涂布在SD/-Trp固体培养基上，30 ℃培养3 d后参照罗维玉等（2016）的方法进行酵母双杂交，挑选SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba（SD/-4/X/A）固体培养基上的蓝色菌落，并接种至SD/-Trp/-Leu（SD/-2）固体培养基上，培养3 d后按照酵母菌质粒提取试剂盒说明提取质粒。

1. 10 酵母质粒提取及回转验证

以1.9中提取获得的候选文库质粒转化DH5α感受态细胞，涂布于含100 ng/μL Amp+的LB培养基上，再挑取单菌落接种至含100 ng/μL Amp+的LB液体培养基中培养，提取质粒并与pGBKT7-σA诱饵质粒（各500 ng）共转化Y2HGold酵母感受态细胞，以pGBKT7-53和pGADT7-T共转化作为阳性对照，pGBKT7-Lam和pGADT7-T共转化作为阴性对照，涂布于SD/-4/X/A培养基上，30 ℃培养3 d，观察酵母菌的生长情况。当SD/-4/X/A培养基上长出菌落且明显变蓝时判为阳性，否则判为阴性。阳性候选酵母菌质粒送至深圳华大基因股份有限公司测序，测序结果在NCBI上进行BLAST比对分析。

2 结果与分析

2. 1 CEF细胞总RNA提取效果

提取的CEF细胞总RNA经紫外分光光度计测定，OD260/OD280为2.01，浓度为240 ng/μL，表明提取的总RNA纯度较高。1.0%琼脂糖凝胶电泳结果（图1）显示，CEF细胞总RNA富含两条特异性条带（28S和18S），小片段5S条带也清晰可见。其中，28S∶18S约2∶1，表明提取的总RNA未发生降解，质量良好，可用于后续的cDNA文库构建。

2. 2 ds cDNA合成与纯化结果

LD-PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果（图2）显示合成的ds cDNA呈弥散状分布，表明不同丰度的mRNA均得到扩增。纯化后的ds cDNA经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果（图3）发现ds cDNA小片段大部分被去除，片段大小主要集中在500～2000 bp，即合成的ds cDNA片段长度适用于cDNA文库构建。

2. 3 文库库容及滴度测定结果

以ds cDNA和pGADT7-Rec共转化的Y187酵母菌液经1∶100倍稀释培养3 d后，SD/-Leu培养基上有109个单菌落，文库库容1.6×106 CFU。收获的cDNA文库按102、104和106倍进行稀释，30 ℃培养3 d后发现106倍稀释的培养基上有31个单菌落（图4），计算得到该文库滴度为3.1×108 CFU/mL。

2. 4 cDNA文库插入片段鉴定结果

随机挑取24个单菌落进行PCR鉴定，结果（图5）显示，扩增片段大小集中在300～2000 bp。24个克隆（单菌落）中仅有2个克隆未扩增出目的条带，重组率为91.67%，表明构建的cDNA文库质量较好，可用于后续的酵母双杂交试验。

2. 5 酵母菌回转验证试验结果

以含有pGBKT7-σA的Y2HGold酵母菌与cDNA文库酵母菌进行双杂交，然后筛选SD-/Trp/-Leu/- Ade/-His/X-α-Gal/Aba（SD/-4/X/A）固体培养基上的蓝色菌落进行回转验证试验，回转验证结果如图6所示。阳性对照和阳性克隆均长出菌落且明显变蓝，而阴性对照未长出菌落。

2. 6 与σA蛋白相互作用的阳性克隆测序结果

将阳性克隆质粒送至深圳华大基因股份有限公司测序，测序结果在NCBI上进行BLAST比对分析，结果得到4个与σA蛋白相互作用蛋白的编码基因，对应的编码蛋白（表1）分别为初期多肽相关复合体α亚基（NACA）、核苷二磷酸激酶2（NME2）、假定蛋白及线粒体核糖体蛋白S9（MRPS9）。

3 讨论

cDNA文库最早由Hofstetter于1976年成功构建获得，最传统的方法是将反转录扩增获得的cDNA酶切后与双酶切的质粒载体连接，但这种方法存在连接效率低、难以扩增、文库cDNA片段较小等缺点（晏慧君等，2006）。近年来，cDNA文库构建技术在不断完善，最常用技术是美国Clontech公司的SMART技术及美国Invitrogen公司的GeneRace试剂盒。酵母双杂交技术目前已广泛应用于蛋白相互作用的研究领域，尤其是病原体蛋白与宿主蛋白相互作用方面，为揭示动物病原分子致病机制、筛选疾病分子标志物和药物靶位、研发新药和疫苗提供了技术保障（谭伟等，2014）。美国Clontech公司研发的Matchmaker双杂交系统不仅提供构建全长cNDA文库的SMART技术，还提供构建cDNA文库、评判cDNA文库质量标准等一系列详细的技术服务。本研究将ds cDNA与pGADT7-Rec表达载体通过同源重组直接连接后共转化Y187酵母感受态细胞，与传统方法将cDNA和载体酶切后连接再转入细胞中的繁琐步骤相比，该方法更快速简便。在利用美国Clontech公司SMART技术构建CEF细胞cDNA文库的过程中，细胞RNA的质量决定了cDNA文库质量。用于cDNA合成的RNA既可是總RNA也可是mRNA，本研究选择总RNA合成cDNA第一链，减少了RNA在纯化过程中的降解（28S∶18S约2∶1），有效保证了cDNA文库的完整性，构建的CEF细胞cDNA文库库容为1.6×106 CFU（大于最低要求的1.0×106 CFU），文库滴度为3.1×108 CFU/mL（大于最低要求的2.0×107 CFU/mL），文库插入片段大小主要集中在300～2000 bp，均满足酵母双杂交试验建库要求。

将成功构建的cDNA文库与pGBKT7-σA诱饵质粒进行酵母双杂交，共筛选出4种互作蛋白，分别为初期多肽相关复合体α亚基（NACA）、核苷二磷酸激酶2（NME2）、假定蛋白及线粒体核糖体蛋白S9（MRPS9）。初期多肽相关复合体（NAC）是新生肽链从核糖体上延伸出来第一个接触的胞质因子，由α和β两个亚基组成，其中NACA主要在转录调控过程中发挥作用，包括激活骨钙素基因、与辅激活类蛋白相互作用、调控FADD（一种死亡结构域蛋白）等一系列功能，且在病毒性疾病中NACA能通过与病毒蛋白相互作用，导致机体功能紊乱（刘娇玲等，2015）。核苷二磷酸激酶（NDPK）可调节细胞增殖、分化、发育和凋亡，还参与细胞的内吞（熊盛等，2006）。假定蛋白是一种功能尚未明确的蛋白，其功能有待进一步研究。核糖体蛋白S9（RPS9）广泛存在于酵母菌、细菌、寄生虫和哺乳动物的细胞中，Kim等（2003）研究证实RPS9与细胞凋亡相关，Lindström和Nistér（2010）也研究发现RPS9能激活p53通路，而p53通路与细胞凋亡有关。本研究采用酵母双杂交技术从构建的CEF细胞cDNA文库中筛选出4种与ARV σA蛋白相互作用的宿主蛋白，可为后期研究互作蛋白对ARV复制及凋亡的分子调控机制打下基础。

4 结论

通过SMART技术构建的CEF细胞cDNA文库具有较好的库容和滴度，且从cDNA文库中筛选出4种与ARV σA相互作用的宿主蛋白，为后续研究互作蛋白对ARV复制及凋亡的分子调控机制提供了可靠数据。

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（責任编辑 兰宗宝）