甜玉米过氧化物酶基因多态性分析

董安忆， 杨亚桐， 牛青敏， 刘松涛， Zenda Tinashe， 段会军

(河北农业大学/华北作物种质资源研究与利用教育部重点实验室， 河北 保定 071001)

甜玉米(sweeten corn)是普通玉米胚乳基因突变而来的，是玉米种群中的一个变种，由于胚乳中和糖分转化有关的基因发生突变，使淀粉合成受阻，导致糖分大量积累。甜玉米比普通玉米具有更高的营养价值，籽粒中富含更多的维生素和氨基酸等营养元素，平均籽粒氨基酸含量比普通玉米高23.2%，蛋白质含量比普通玉米高1倍左右，葡萄糖、蔗糖和果糖含量高7倍，硒的含量高8～10倍[1-3]。

过氧化物酶基因是一个多基因家族,在植物体中活性较高，且在生物界中广泛存在，与植物的氧化作用、呼吸作用和生长素在体内的化学作用休戚相关[4-5]。过氧化物酶为细胞抵御活性氧伤害的重要酶系统[6]，随着植物的生长发育，过氧化物酶工作重心会做出相应调整，用以配合稳定生物体代谢过程[7]，调控应激反应[8]，过氧化物酶基因为多基因家族，众多研究表明通过胁迫刺激可以影响其表达[9-10]。

国内外研究学者在过氧化物酶研究方面已经做了大量的工作。任晓月等基于过氧化物酶多态性，运用聚丙烯酰胺凝胶电泳垂直板电泳技术对不同地区罗布麻进行遗传多样性分析，结果显示其Rf值在0.547～0.882之间，亲缘关系较近[11]。陈雯等运用聚丙烯酰胺凝胶电泳垂直板电泳技术对麻疯树进行过氧化物酶分析，其遗传距离在0.72～1.0范围内[12]。刘文倩等对12种不同表型的披针叶八角植物进行过氧化物酶分析，在相似系数为0.7处可将供试植物分为3类，与其来源地有较高的相关性[13]。赵广华对19种木兰科植物进行过氧化物酶遗传分析，结果表明，供试材料被分为4类[14]，与《中国植物志》[15]中的分类基本一致。

表2 10对引物序列

引物名称序 列 引物名称序 列 Pox1F5'-CTCGACCTACAAGGAC-3'Pox1R5'-ATGTAGGCGCTGGTGA-3'Pox2F5'-CTCGACGTCAAGGACCTC-3'Pox2R5'-GCCCATCTTCACCATGG-3'Pox3F5'CAACGAAGACCAACATCGA-3'Pox3R5'-CCTGATCTGTCCCTGCG-3'Pox4F5'-CACCATCAAGAGCGTCATAAC-3'Pox4R5'-TTGGGCGTCGTCGTGT-3'Pox5F5'-GGCGTCGGCGTCG-3'Pox5R5'-ATCGGGAAGCTTCCCCTC-3'Pox6F5'-CCACGCCCTCATCGC-3'Pox6R5'-CATCTGGCCGTGCGTC-3'Pox7F5'-CCTTCTTCTTGCCATCTTGC-3'Pox7R5'-CATATCGCTCCACGACCTTT-3'Pox8F5'-CGAGCTGAGAGTGAATCGATC-3'Pox8R5'-CTTGAACGCCTGGATGAGC-3'Pox9F5'-GACGGTTCTATTGGGAAGAAG-3'Pox9R5'-CATGAAAGTGATGAGATGGC-3'Pox10F5'-CTCATCGTTAACGTCGCATC-3'Pox10R5'-GATGCAAGGAGTATAGTGCAAATG-3'

注：F为正向引物，R为反向引物。

虽然利用过氧化物酶基因多态性(POGP. Peroxidase gene polymorphism)在多种植物中进行了研究，但是在甜玉米种质中报道的还很少。本研究利用过氧化物酶保守区域设计引物对甜玉米种质进行过氧化物酶基因多态性评价，以明确甜玉米种质资源的遗传多样性，为甜玉米育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的34份材料(表1),均为河北农业大学玉米育种团队从全国各地收集。

1.2 试验方法

1.2.1DNA提取与浓度测定

通过利用CTAB法[15-17]对供试的34份甜玉米进行基因组叶片DNA提取，然后用紫外分光光度计测量DNA的浓度，之后放置在-20 ℃的冰箱中保存以备使用[18-19]。

1.2.2引物设计

基于玉米过氧化物酶cDNA序列设计引物，这些序列可在National Center for Biotechnology Information(NSBI,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站上找到。使用Clustalx 软件对过氧化物酶cDNA序列进行序列相似性聚类及比对，找到相似性序列即保守区域序列。根据正向引物和反向引物的退火温度调整引物长度(表2)。

表1 34份甜玉米自交系

编号名称来源编号名称来源1116379河北18M6-1-6河北2甘甜2甘肃19M5-1河北3红M7河北20M5-c河北4紫Su5-12河北21石黄甜河北5TS河北22116375河北6保甜1河北23白甜1河北7116359河北24紫Su5-3河北8116329河北25116327河北9超甜玉米-3河北26紫Su5-3-3河北10GT4不详27116432河北11甘紫甜1甘肃28GT1不详12M638河北29黄粘甜不详13超甜-1河北30116394河北14116484河北31MS河北15116377-78河北32HHT海南16116424河北33超甜-2河北17116469河北34116385河北

1.2.3PCR扩增

PCR 反应体系为 25μL，包括5 ng·μL-1DNA 模板 2μL，10μmol·L-1前后引物各 1μL，10×Buffer 2.5μL， dNTP 1.6μL，TaqDNA 聚合酶0.3μL，去离子水16.6μL，待体系混合均匀后加入1小滴矿物油(全过程在冰盒上进行)。

PCR 反应程序为：95 ℃ 2 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35 个循环；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。PCR 扩增在 Biometra 型 PCR 仪上进行。扩增完成后，放入4 ℃保存。

图1 POX 2引物扩增电泳图

1.2.4琼脂糖凝胶电泳

扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳进行分离检测。然后，把电泳完成后的凝胶放入BIO RAD凝胶成像系统(Serial No:721 BR 13708)中进行观察记录[20-21]。

1.3 数据分析

以 0、1 记录凝胶电泳结果，在指定迁移位置有带记为 1，无带记为 0，缺失记为9，构建所有引物扩增结果数据库。利用SPSS软件对数据进行聚类分析和遗传相似性分析，构建相似性矩阵，利用组内联接的聚类分析方法研究甜玉米种质间的遗传关系。

2 结果分析

2.1 扩增结果分析

利用10对引物对34 份甜玉米种质进行扩增(图1)。共扩增出了34条DNA条带，其中多态性条带21条，占扩增总带数的61.76%，表明10对不同引物组合(表2)的多态性存在明显差异(表3)。

表3 10对引物组合对34份甜玉米材料的扩增结果

引物总带数多态性带数多态性频率/%Pox18675.0Pox25480.0Pox322100.0Pox43133.3Pox53133.3Pox622100.0Pox73266.67Pox82150.0Pox93133.3Pox103133.3总计342161.76

2.2 基于过氧化物酶基因的遗传多样性分析

据SPSS软件统计，34份甜玉米种质资源间的遗传相似系数显示,遗传相似系数越大表明亲缘关系越近，反之亲缘关系越远。本试验遗传相似系数变化范围为0.674～0.978，说明供试材料间遗传分化不明显，本试验甜玉米种质资源的遗传基础相对狭窄。

2.3 基于过氧化物酶基因标记的甜玉米品种的聚类分析

根据遗传相似系数矩阵，基于欧式距离对供试玉米自交系进行组内联接的聚类分析树状图(图2)结果显示，可以将34份甜玉米自交系分为4类，其中第一大类材料包括石黄甜，紫Su 5-3，116375，116329，紫Su 5-12,116359,116484,116377-78和116394；第二大类有GT 4,M 5-c，超甜玉米-3，116469,TS和黄粘甜；第三大类材料包括116379，甘甜2，HHT,超甜-2,白甜1，超甜-1和MS；第四大类材料包括M 638,M 616，116327，紫Su 5-3-3,116432,红M 7，116385,保甜1，甘紫甜1,116424，M 5-1和GT 1。其中第一大类为普通甜玉米，第二，三，四类为超甜玉米。

3 讨 论

利用过氧化物酶高度保守区域设计引物已应用于大豆[22]、烟草[23]、水稻[24]、棉花[25]，这为甜玉米遗传多样性研究提供了有力的理论指导。刘志雄认为，获得SSR分子标记一般需要建立、筛选基因文库,克隆测序,引物设计等,耗费大量人力物力[26]。胡建广等认为，RAPD引物较短，PCR退火温度相对较低，重复性较差[27]。因此，利用SSR或RAPD都存在着一些不足，而本研究利用过氧化物酶保守区域设计引物结果显示，10对引物共扩增出了34条DNA条带，其中多态性条带21条，占扩增总带数的61.76%。其带型片段显示重复稳定，说明了该技术的准确性，高效性。因此，利用过氧化物酶保守区域设计引物对甜玉米种质进行遗传分析是一种真实可靠的工具。

本试验对34组甜玉米材料进行聚类分析，将其划分为四大类。其中，超甜玉米姊妹系M 638和M 616被划分在FCGⅣ中，说明其遗传关系较近；亲缘关系较近的紫Su 5-12、紫Su 5-3在一个类群中，其中紫Su 5-3-3不与其在同一类，可能是由于品种混杂，环境因素也可能是由于所用引物数量的限制使之未被精确分类等。遗传相似系数范围为0.674～0.978，表明所选材料遗传基础比较狭窄,这与冯艳等[28]、张姿丽等[29]的结果基本一致。因此，要注重甜玉米资源的引进与发掘，从而拓宽甜玉米种质资源多样性。总之，聚类分析可以比较准确快速地对甜玉米进行类群划分，对甜玉米亲缘关系研究具有一定的参考价值[30]。

综上所述,利用过氧化物酶高度保守区域设计引物对甜玉米种质进行过遗传多态性分析,对于甜玉米种质资源的研究、改良、优化、杂交亲本组配具有一定的参考价值。但还应结合甜玉米的田间表现、生理生化指标、配合力[31]等来推断其遗传多样性[32]，从而深化对甜玉米种质资源遗传多样性的研究与合理利用。

图2 34份自交系基于欧氏距离的聚类分析图