14种抗结核药物在巨噬细胞内的抗结核活性评价

陈曦 刘忠泉 王彬 朱慧 付雷 李媛媛 陆宇

结核分枝杆菌是一种细胞内寄生菌，可在巨噬细胞内存活并繁殖，凭借在巨噬细胞内生长的特性逃逸机体免疫防御作用。治疗结核分枝杆菌感染的关键是选用具有良好抗菌活性并且能在巨噬细胞内达到有效抑菌浓度的药物。因此，在评估一种药物对结核分枝杆菌是否有效时，不仅要评估其细胞外抗菌活性，也要评估其细胞内抗菌活性。为提高耐药结核病治疗的有效性，围绕新的药物靶点开发新型抗结核药物已成为当务之急。体外药效学评价是抗结核新药研发的第一步，也是关键步骤；其中抗结核药物细胞内抗菌活性是进行体外药效学评价的重要指标之一。本研究针对目前开发的新型抗结核药物，以及临床上应用的抗结核药物进行了巨噬细胞内抗菌活性比较，并且对抗结核药物的胞内浓度进行了分析，评价体外巨噬细胞内抗结核活性测定对新药筛选的作用。

材料和方法

一、仪器与材料

1. 仪器：高效液相色谱-质谱工作站(UPLC-MS/MS分析系统，由Agilent1290高效液相色谱仪和Agilent6460质谱检测器组成，安捷伦科技有限公司，美国)、Thermo Fisher低温离心机(赛默飞世尔科技有限公司，美国)、METTLER-TOLEDO电子分析天平(梅特勒-托利多集团公司，瑞士)、Milipore 超纯水机(默克密理博科技有限公司，美国)、二级生物安全柜(艺思高科技有限公司，新加坡)、二氧化碳培养箱(赛默飞世尔科技有限公司，美国)、Tecan Infinite 200酶标仪(帝肯集团公司，瑞士)。

2. 试剂与材料：0.25% 胰蛋白酶、胎牛血清、DMEM细胞培养基(Gibco生命科技有限公司，美国)、Middlebrook 7H9 (BD 生物科技有限公司，美国)、1×磷酸盐缓冲液(PBS)、生理盐水、0.1% SDS裂解液、Middlebrook 7H10 (BD 生物科技有限公司，美国)、OADC增菌液(BD 生物科技有限公司，美国)、色谱纯甲醇、色谱纯乙腈、超纯水。

3. 实验药物：利福平(RFP，Sigma，BCBP4553V)、异烟肼(INH，Sigma，MKBV9495V)、左氧氟沙星(Lfx，Sigma，BCBF7004V)、吡嗪酰胺(PZA，Sigma，031M1778V)、贝达喹啉(TMC207，上海瀚香生物科技有限公司，843663-66-1)、硝基咪唑类药物PA-824(Sigma，187235-37-6)、利奈唑胺(LZD，中国医学科学院药物研究所)、氯苯吩嗪(CFZ，上海瀚香生物科技有限公司，2030-63-9)、苯并噻嗪酮类药物PBTZ-169和BTZ-043(中国医学科学院药物研究所)、利奈唑胺同类药物OTB-658(中国医学科学院药物研究所)、氯苯吩嗪衍生物TBI-166(中国医学科学院药物研究所)、TZY-5-84(中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所)、NTB-3119H(中国医学科学院药物研究所)。

4. 细胞与菌株：J774.1 巨噬细胞(购自北京协和细胞资源中心)、结核分枝杆菌H37Rv标准株(ATCC 27294，北京市结核病胸部肿瘤研究所药物研究室冻存)。

二、 实验方法

本研究于2018年9月至2019年3月测定了14种抗结核药物的最低抑菌浓度和巨噬细胞内抗结核活性；并测定了其中8种抗结核药物在巨噬细胞内的药物浓度。

(一)最低抑菌浓度测定

采用微孔培养显色法(MABA法)测定90%最低抑菌浓度(MIC90)。

(1) 结核分枝杆菌单菌落悬液制备：结核分枝杆菌H37Rv接种于含10% OADC、0.05%吐温-80的7H9液体培养基中，于37 ℃、5% CO2培养2～3周至对数生长期，8 μm滤膜过滤细菌悬液，获得单菌悬液，菌液经10倍稀释后接种于7H10固体培养基，4周后进行菌落计数，确定单菌悬液的浓度(CFU/ml)(CFU：菌落形成单位)。(2)药物的制备及菌液接种：取无菌96孔培养板，第1排前6孔加入200 μl 7H9培养基，设为阴性对照孔，后6孔加入100 μl 7H9培养基和等体积的单菌落悬液，设为阳性对照孔；除第1排外，其余各排第1列分别加入含有实验药物(RFP、INH、Lfx、PZA、TMC207、CFZ、LZD、PA-824、TBI-166、OTB-658、PBTZ-169、BTZ-043、TZY-5-84、NTB-3119H)的7H9培养基200 μl，剩余各孔分别加入100 μl 7H9培养基，从第1列吸取100 μl含药培养基加入第2列，依次连续倍比稀释至最后一列。然后在除阴性对照孔之外的各孔中加入制备好的单菌落悬液100 μl，使每孔中最终培养容积均为200 μl，菌液终浓度为4×105CFU/ml。(3)孵育条件：37 ℃培养7 d。(4) 加入显色试剂：在已培养7 d的96孔培养板中，每孔加入Alamar Blue 20 μl，20% 吐温-80 12.5 μl，混合均匀(避光操作)。37 ℃继续培养24 h。(5)结果判读：应用酶标仪测定吸光度值，并计算MIC90。

(二)巨噬细胞内抗结核药物活性测定

(1)J774.1单核巨噬细胞的制备：在75 cm2细胞培养皿中用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，待细胞生长至占培养皿面积的80% 时，以0.25% 胰蛋白酶2 ml室温消化1 min，弃去胰酶后加入5 ml含10%胎牛血清的DMEM培养基，吹打贴壁巨噬细胞，制成细胞悬液；用含10%胎牛血清的DMEM培养基调整细胞浓度至4×105个/ml，在24孔细胞培养板中每孔加入1 ml细胞悬液，于37 ℃、5% CO2培养箱孵育16 h，贴壁细胞用于结核分枝杆菌的感染。(2)结核分枝杆菌感染巨噬细胞：用含10%胎牛血清的DMEM培养基将结核分枝杆菌冻存菌液稀释为2×106CFU/ml的细菌悬液。向孵育贴壁巨噬细胞的24孔细胞培养板中加入1 ml/孔的细菌悬液，即感染复数为5∶1；37 ℃孵育3 h，吸弃含菌培养基，用无菌1×PBS洗涤2次，以除去胞外结核分枝杆菌。(3)实验药物的制备及处理细胞：精密称取14种抗结核药物RFP、INH、Lfx、PZA、TMC207、CFZ、LZD、PA-824、TBI-166、OTB-658、PBTZ-169、BTZ-043、TZY-5-84、NTB-3119H，用二甲基亚砜(DMSO)或超纯水溶解并定容为1 mg/ml。用含10%胎牛血清的DMEM培养基分别稀释待测药物，终浓度设为5、2和0.50 μg/ml。向含有已感染结核分枝杆菌的贴壁巨噬细胞的24孔培养板中加入新鲜配制的含有不同浓度实验药物的培养基，2 ml/孔，37 ℃孵育72 h。并设不经药物处理的阴性对照孔，所有试验孔均设复孔。(4)巨噬细胞的裂解及细胞内结核分枝杆菌计数：药物处理贴壁巨噬细胞72 h后，吸弃含药培养基，向24孔细胞培养板各孔中加入200 μl 0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)，37 ℃ 静置5 min以裂解细胞，随后各孔中加入800 μl含10%胎牛血清的DMEM培养基，中和裂解，裂解液混匀后用生理盐水进行10倍系列稀释。分别取100 μl不同浓度的稀释液接种到7H10固体培养板上，37 ℃、5% CO2温箱中培养3～4周，进行菌落计数。

(三)巨噬细胞内抗结核药物浓度测定

(1)J774.1单核巨噬细胞的制备：用含10%胎牛血清的DMEM培养基调整巨噬细胞浓度至1×106个/ml，在直径9 cm细胞培养皿中加入10 ml细胞悬液，使细胞数量为1×107个/培养皿，于37 ℃、5% CO2培养箱孵育16 h，吸弃培养基，贴壁细胞用于药物处理及检测实验药物的细胞内浓度。(2)药物的制备与处理巨噬细胞：用含10%胎牛血清的DMEM培养基分别稀释待测的8种抗结核药物RFP、INH、Lfx、TMC207、CFZ、LZD、TBI-166、PBTZ-169，终浓度分别为20、10和5 μg/ml。向孵育贴壁细胞的培养皿中加入10 ml各浓度的含药培养基，药物处理细胞3 h后，弃去含药培养基，加入1×PBS洗涤1次，以去除细胞外药物。所有试验均设不经药物处理的阴性对照，脂溶性药物RFP、TMC207、CFZ和抗结核新化合物TBI-166、PBTZ-169测定试验中设置药物处理的0 h对照。(3)收集细胞及待测样品：向药物处理后的细胞培养皿中加入2 ml的0.25% 胰蛋白酶，消化20 s；随后加入3 ml 新鲜培养基中和胰酶，吹打贴壁细胞使其悬浮，收集细胞悬液，4 ℃ 100×g离心5 min，弃去培养基，每份细胞样品加入1 ml去离子水，重悬细胞后4 ℃放置1 h，经镜下观察确认细胞完全裂解。细胞裂解液4 ℃ 2000×g离心10 min，留取沉淀加入1 ml去离子水混匀，同时留取上清液。不经含药培养基孵育的细胞阴性对照样品收集方法同上。(4)高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法测定药物浓度：巨噬细胞内药物浓度测定方法见文献[1-2]。取未经药物处理的空白细胞裂解液分别稀释实验药物标准品，分别制备标准曲线。各取上一步中收集的离心沉淀悬液和上清液样品200 μl加入等体积的乙腈，充分混匀， 4 ℃ 13 800×g离心10 min，收集上清进行质谱分析。色谱条件：根据实验药物选择甲醇-甲酸铵水溶液(含5 mmol/L 甲醇和0.1%甲酸；85∶15, v/v)或乙腈-甲酸铵水溶液(含5 mmol/L 乙腈和0.1%甲酸；8∶92,v/v)为流动相，色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱[2.1 mm×100 mm,3.5 μm(柱子直径2.1 mm，长度100 mm，柱子中硅胶填料粒径3.5 μm)]，流率为0.2 ml/min；柱温：40 ℃；进样量：3 μl；质谱条件：质谱采用电喷雾离子源(ESI)，扫描方式为正离子模式，选择多反应离子监测(MRM)方式扫描。

三、统计学处理

CFU计数转换为lg(CFU/ml)，应用SPSS 23.0软件进行区组资料的多因素方差分析，比较各药物处理组与未经药物处理组间巨噬细胞内结核分枝杆菌的lg(CFU/ml)，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、MIC90测定

药物的胞外MIC90见表1。结果显示，胞外抗结核活性最强的药物为苯并噻嗪类的PBTZ-169和BTZ-043，其MIC90分别低至0.0005 μg/ml和0.002 μg/ml。抗结核活性最弱的为PZA，其MIC90高达200 μg/ml。

二、 巨噬细胞内药物的抗结核活性检测

受试药物在巨噬细胞内的抗结核活性数据见表1。 RFP、INH、Lfx、TMC207、PA-824、CFZ、TBI-166、NTB-3119H、LZD、TZY-5-84、PBTZ-169和BTZ-043呈明显的剂量-效应关系。细胞培养基中药物浓度为0.50 μg/ml时，INH、PBTZ-169、TMC207、BTZ-043、NTB-3119H、TZY-5-84、PA-824分别降低巨噬细胞内结核分枝杆菌1.60、1.33、1.31、1.25、1.13、1.01 和1.00 lg(CFU/ml)；细胞培养基中药物浓度为2 μg/ml时，INH、PBTZ-169、TMC207、CFZ、NTB-3119H、BTZ-043、TZY-5-84、Lfx、PA-824分别降低巨噬细胞内结核分枝杆菌2.18、1.91、1.65、1.55、1.47、1.44、1.29、1.24和1.15 lg(CFU/ml)；细胞培养基中药物浓度为5 μg/ml时，PBTZ-169、NTB-3119H、INH、CFZ、TMC207、PA-824、TZY-5-84、BTZ-043、RFP、Lfx和TBI-166分别降低巨噬细胞内结核分枝杆菌4.78、2.48、2.33、2.09、1.91、1.48、1.48、1.46、1.44、1.37 和1.34 lg(CFU/ml)。胞内活性最强的为INH、PBTZ-169和TMC207，其中PBTZ-169在5 μg/ml时，显示出了完全的杀菌活性；与其他抗结核药物相比，同属一类的LZD和OTB-658的胞内抗结核活性弱，PZA的胞内抗结核活性微弱。

表1 细胞培养基中各种药物在不同浓度时巨噬细胞内单菌悬液的浓度和体外MIC90值

注5 μg/ml、2 μg/ml、0.5 μg/ml、0 μg/ml为培养孔内细胞培养基中的药物浓度；阴性对照为培养孔内的巨噬细胞在不含药物的同等容积细胞培养基中培养；“-”：无值。lg(CFU/ml)降低值=阴性对照单菌悬液的lg(CFU/ml)均值(4.78)—培养基中不同药物浓度时巨噬细胞内单菌悬液的lg(CFU/ml)均值

三、抗结核药物在巨噬细胞内浓度分析

药物在巨噬细胞内的浓度见表2。为排除脂溶性药物RFP、TMC207、CFZ和抗结核新化合物TBI-166、PBTZ-169 与细胞壁结合对巨噬细胞内药物浓度测定的影响，笔者测定了这些药物和化合物处理细胞0 h时细胞裂解液中的药物浓度，并以此为基线。在培养基中药物浓度为5 μg/ml时，PBTZ-169、TMC207、RFP、CFZ、TBI-166和Lfx在巨噬细胞内的浓度为0.60、0.80、0.48、0.78、0.17和0.37 μg/ml，分别为其MIC90值的1200.00、26.67、9.60、6.50、4.25和1.48倍，且随着培养基内药物浓度的升高二者比值也相应升高。虽然只在培养基含药浓度为20 μg/ml时测出INH的胞内浓度，但其与MIC90的比值也高达5.40倍；与上述几种药物相比，LZD 的巨噬细胞内浓度与MIC的比值只在培养基中药物浓度提高至20 μg/ml时才升高到1.28倍，这些结果提示不同的抗结核药物进入巨噬细胞的能力存在较大差异，也表明其进入巨噬细胞的能力即细胞内药物浓度以及与MIC的关系是细胞内活性的决定因素。

讨 论

巨噬细胞对于结核分枝杆菌来说，不仅是逃逸宿主免疫效应的避风港，而且也是逃避药物杀伤的屏障。药物若要对巨噬细胞内吞噬的结核分枝杆菌发挥作用，必需经过进入巨噬细胞、溶酶体及结核分枝杆菌细胞膜的过程，因此药物进入巨噬细胞是发挥细胞内抗结核活性所必需的。此外，还与各种药物对结核分枝杆菌的最低抑菌浓度相关。本研究评价不同作用靶点的14种抗结核药物在巨噬细胞内、外的抗结核活性，以说明巨噬细胞内抗结核活性的作用及相关性。

表2 8种抗结核药物在巨噬细胞内的浓度

注“-”：未测出或未检测；3 h-0 h：3 h与0 h的胞内药物浓度差值；胞内药物浓度/MIC90值：带a角标的数值与MIC90值的比值

本研究中MABA法测得的MIC90结果与文献报道一致[3-4]。笔者发现LZD和OTB-658的细胞外抗菌活性(MIC90)与细胞内抗菌活性并不完全一致，其MIC90均较低，但并未表现出良好的胞内抗菌活性。其中LZD已应用于临床治疗，其在临床化疗中的优势与其对细菌的灭菌活性相关。上述两种药物的体外MIC90结果和细胞内活性的非对应关系，提示了药物的体外MIC90结果的局限性，也显示细胞内活性测定的重要作用；但二者均为体外活性的评价方法，药物活性评价必须要进行感染动物实验的药效评价，以更准确地评价新药的抗结核活性。但对于PBTZ-169、BTZ-043、TMC207、PA-824来说，其胞内、外抗菌活性均表现优异，抗结核活性最佳的PBTZ-169与BTZ-043，二者同属于苯并噻嗪类药物，BTZ-043的72 h内杀菌活性与INH相似，细菌代谢的最早阶段即可被其阻止[5]；PBTZ-169的活性更优于BTZ-043，在5 μg/ml时，表现出完全的胞内杀菌活性，这与文献报道结果一致[6-7]。分析其原因：(1)PBTZ-169与BTZ-043具有良好的体外抗结核活性，MIC90值低；(2)PBTZ-169与BTZ-043均具有进入巨噬细胞的能力并达到了MIC90值以上。吡嗪酰胺在人体中胞内杀菌效果较好，但本研究发现PZA在体外的细胞内抗结核活性比较差，这与Heifets等[8]的研究结果类似；因PZA需要在酸性环境下才能发挥抗结核活性，因此推测在本研究模型中PZA进入巨噬细胞后尚未被吞噬溶酶体摄取，胞质中pH条件不是PZA发挥杀菌活性的最佳条件。

抗结核药物细胞内药效评价涉及因素较多。郑海琴等[9]之前的研究显示，感染复数、感染时间和药物作用时间均对胞内抗结核活性有影响；另外，还发现感染菌的活力也会对结果产生影响，因此本研究对上述影响因素进行了进一步的优化。用于结核分枝杆菌感染的巨噬细胞系常选用RAW264.7和J774.1两种，相比RAW264.7细胞，虽然J774.1细胞传代后贴壁时间稍长，但是细胞生长状态更易保持稳定且不易向终末细胞分化，因此本研究中选用J774.1细胞系作为感染模型。

抗结核药物在巨噬细胞模型中的细胞内浓度是评价其活性的重要内容之一。目前，测定细胞内药物浓度的方法主要有高效液相色谱法和液质联用法。本研究采用HPLC-MS-MS方法直接测定细胞内药物浓度。 Baietto等[10]用超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS-MS)方法测定了EMB、INH、RFP与PZA在患者外周血单核细胞(PBMC)内的浓度，与本研究相比，这些药物进入PBMC和巨噬细胞内的能力并不相同。

本研究表明，与体外MIC90测定相比较，药物在巨噬细胞内的浓度可以体现出药物进入巨噬细胞的能力，是胞内发挥抗结核活性的重要因素，也是发现新药不同体外活性的一个重要评价内容。在临床治疗药物选择组成方案时，要充分考虑各种药物的抗菌活性与特性，结核分枝杆菌是胞内致病菌，选择能在巨噬细胞内达到有效抑菌浓度的抗菌药物，即选择那些能够有效渗透进入细胞的抗结核药物非常重要。

本研究的局限之处是没有采用多种细胞模型，以及没有纳入更多的抗结核药物。在后续的研究中，随着更多药物的纳入，以及针对各种药物在巨噬细胞内PK/PD 的研究及细胞器分布，必将丰富及完善巨噬细胞内抗结核药物活性研究的理论，并为开展后续的体内实验及临床应用提供帮助。