攀枝花钒钛磁铁尾矿土壤中苜蓿根瘤菌的多样性与促生效应

胡蓝方，李艳梅，沈 甜，王 娟，任泓霖，韦宇脉，谢雨歆，闫 敏，朱 军，余秀梅

（四川农业大学资源学院，成都 611130）

攀枝花市位于中国西南川滇交界处，钒钛磁铁矿产资源极为丰富。钒钛磁铁矿中含有大量Fe、V、Ti，同时伴生有 Cr、Cu、Zn、Mn、Ni 等。长期开采导致矿区土壤重金属污染严重，生态环境十分脆弱[1]。土壤重金属污染可被植物吸收富集，通过食物链在动物和人体内累积，对人体健康构成严重威胁。生物修复因具备操作简单、成本低、无二次污染等优点而被广泛应用于重金属污染土壤修复[2]。其中，植物-微生物联合修复技术主要利用根际微生物的促生作用提升植物生物量或通过氧化还原反应等作用改变重金属生物有效性来强化植物修复，已成为国内外研究热点[3]。

根瘤菌与豆科植物共生结瘤固氮作用可以补充植物氮营养、促进植物生长、增加植物的抗病性和抗逆性，还可修复重金属、多环芳烃等污染土壤[4]。据报道，根际接种根瘤菌使鹰嘴豆植株铜含量降低，但生物量显著增加[5]。豆科草本植物紫花苜蓿（Medicago sativa）因具抗逆性强、耐瘠薄等特点，被认为是应用前景较好的土壤污染修复豆科植物[6]。紫花苜蓿已应用于植物修复铅锌尾矿、铁矿排土场等研究中，能显著降低矿区土壤中 Cu、Zn、Cd、Pb 浓度[7-9]，但其应用于钒钛磁铁尾矿土壤修复的相关研究尚无。

豆科乔木植物水黄皮-根瘤菌联合技术在攀枝花钒钛磁铁尾矿土壤中表现出较好的修复效果，尤其对Fe、Ni 富集修复效果明显[10]，但存在此乔木修复技术对空间利用不足的问题。对攀枝花钒钛磁铁尾矿土壤中苜蓿根瘤菌进行捕获分离及遗传多样性研究，并筛选出本土高效的共生固氮苜蓿根瘤菌，以为苜蓿—根瘤菌联合修复攀枝花钒钛磁铁尾矿土壤污染提供可利用的根瘤菌资源和科学依据。

1 材料和方法

1.1 苜蓿根瘤菌的捕获

采集攀枝花新九乡的钒钛磁铁尾矿土壤，开展室内盆栽试验捕获土著苜蓿根瘤菌，即：选择饱满的紫花苜蓿种子，先后用1‰ HgCl2和95%酒精进行表面灭菌5 min，用无菌水清洗数次，再将其播种在装有尾矿土壤的口径20 cm 左右的花盆中，放置于光照室（25 ℃光照 17 h，17 ℃黑暗 7 h）中培养，并不定时地统一补充足够的无菌水，3 个月后收获红润饱满的苜蓿根瘤。

1.2 苜蓿根瘤菌的分离与纯化

对获得的根瘤用乙醇和HgCl2进行表面灭菌，捣碎，划线于YMA 培养基（甘露醇1.0 g/L，酵母浸出粉 1.0 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，琼脂粉 18 g/L，pH 值 7.0～7.2），置于28 ℃培养箱中恒温培养2～3 d，挑取单菌落，进行革兰氏染色镜检直至得到纯菌，保种在YMA 斜面培养基置于4 ℃冰箱中待用，并保存于30%甘油置于-80 ℃冰箱中备用[11]。

1.3 苜蓿根瘤菌总DNA的提取

将供试菌株接种于TY 液体培养基（胰蛋白胨5 g/L，酵母浸出粉 3 g/L，CaCl2·2H2O 0.7 g/L）中，在28 ℃、150 r/min 摇床中培养 2～3 d，收集菌液于 1.5 mL EP 管中，采用试剂盒的方法提取根瘤菌总DNA，试剂盒购于生工生物工程（上海）股份有限公司。用1%琼脂糖凝胶电泳检测后保存于-20 ℃冰箱中待用。

1.4 根瘤菌16S rRNA基因的扩增和系统发育分析

16S rRNA 基因扩增采用通用引物 27F 和1492R[12]，序列分别为5'-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3' 和 5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'，PCR 扩增采用 30 μL 体系（mix 15 μL，27F 0.15 μL，1492R0.15μL，DNA1μL，ddH2O 13.7 μL），扩增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 10 min。

扩增产物用含EB 的1%琼脂糖凝胶电泳检测并送至成都擎科公司测序，测序结果在NCBI 中进行BLAST 比对，得到16S rRNA 基因的序列相似性及同源基因[15]，建立供试菌株的16S rRNA 基因系统发育树。

1.5 持家基因atpD、rpoB 和glnII 基因扩增和系统发育分析

对持家基因 atpD、rpoB 和 glnII 序列进行扩增[13]，atpD 基因扩增采用引物 255F 和 782R，序列分别为5'-GCT SGG CCG CAT CMT SAA CGT C-3'和5'-CCG ACA CTT CMG AAC CNG CCT G-3'，PCR 扩增采用 30 μL 体系（mix 15 μL，255F 0.15 μL，782R 0.15 μL，DNA 1 μL，ddH2O 13.7 μL）；扩增程序为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30 个循环；72 ℃7 min。rpoB 基因扩增采用引物 454F和1364R，序列分别为5'-ATCGTCTCGCAGATG CACCG-3'和 5'-TCGATGTCGTCGATYTCGCC-3'，PCR 扩增采用 30 μL 体系（mix 15 μL，454F 0.15 μL，1364R 0.15 μL，DNA 1 μL，ddH2O 13.7 μL），扩增程序为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30 个循环；72 ℃ 7 min。glnII 基因扩增采用引物 12F和tsR，序列分别为5'-YAAGCTCGAGTACATYTGGCT-3' 和 5' -GAGCCGTTCCAGTGGTGTCG -3'，PCR 扩增采用 30 μL 体系（mix 15 μL，12F 0.15 μL，tsR 0.15 μL，DNA 1 μL，ddH2O 13.7 μL），扩增程序为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30 个循环；72 ℃ 7 min。

扩增产物测序结果在NCBI 中进行BLAST 比对，获得苜蓿根瘤菌的相近模式菌株持家基因序列，建立供试菌株的持家基因系统发育树。

1.6 根瘤菌回接与共生固氮效率测试

回接试验采用Lenoards Jar 装置[14]来种植苜蓿，称取定量的蛭石装入啤酒瓶中，用蒸馏水润湿基质，并在下方的塑料底瓶中加入750 mL 无氮营养液，上方用封口膜密封在1×105Pa 下灭菌30 min，冷却后备用。挑选已经表面灭菌和无菌条件下催好芽的种子种在装置中，并在表面铺上无菌干燥石英砂以防止杂菌进入装置中。待苜蓿长出土表1～3 cm左右接种根瘤菌菌液。将纯化保种的根瘤菌接种到5 mL TY 液体培养基中，在150 r/min 28 ℃条件下摇培2 d，向每个盆栽中接种3 mL 菌液（108/mL）。将装置置于光照室（25 ℃光照17 h，17℃黑暗7 h）中进行盆栽试验，在种植期间不定时统一用无氮营养液（KCl 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，KH2PO40.2 g/L，FeEDTA 1 mg/L，CaSO4·2H2O 0.2 g/L，CaCO32 g/L，Trace 10 ml/L）进行补充，并对其进行根瘤菌有无的观察。3 个月后收获植株，将植株置于108 ℃烘箱中杀青 30 min，80 ℃烘干至恒重，用 H2SO4-H2O2对植物样品进行消煮，用凯氏定氮法测定其总氮含量。

1.7 数据处理与分析

供试菌株的16S rRNA 基因与参比菌株序列用MEGA7.0 软件采用最大似然法[15]（maximum likelihood）进行分析，构建供试菌株的16S rRNA 基因系统发育树。供试菌株的持家基因与参比菌株序列用MEGA7.0 对 atpD、rpoB、glnII 基因分别进行比对，以最小长度为标准剪齐，将3 个序列拼接在一起采用最大似然法对根瘤菌的持家基因构建联合系统发育树。

根瘤菌回接苜蓿的共生固氮效率用Microsoft Excel 2013 进行处理，试验数据用SPSS 22.0 进行单因素方差分析，结果用P＜0.05 作为显著差异判断依据，数据结果均用平均值标准差表示。

2 结果与分析

2.1 苜蓿根瘤菌的纯化分离

对根瘤内的根瘤菌进行分离纯化，选择菌落形态呈黏液状、边缘整齐、透明、半透明或不透明、颜色为乳白色的根瘤菌培养物进行革兰氏染色，显微镜观察为革兰氏阴性杆状菌。共得到46 株菌株。

2.2 16S rRNA基因序列系统发育分析

对纯化分离出46 株菌的16S rRNA 基因进行测序，基因序列在NCBI 中BLAST 比对分析发现，9株菌为根瘤菌，编号为MX1-MX9。9 株菌分别与中华根瘤菌属（Sinorhizobium）、根瘤菌属（Rhizobium）和慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）的16S rRNA 基因相似性达98%～100%。采用MEGA7.0 的最大似然法对9 株菌和24 株根瘤菌标准模式菌株构建系统发育树（图1），结果表明这9 株菌分别属于中华根瘤菌属、根瘤菌属和慢生根瘤菌属。其中菌株MX1和MX4 与参比菌株S.meliloti IAM 12611T聚在一个分支，序列相似性达99%，属于中华根瘤菌属。MX2 和MX5 距离较近，均与参比菌株R.radiobacter IAM 12048T聚在一个分支，序列相似性达99%；MX8 单独处于一个小分支上，与参比菌株R.leguminosarum ATCC 10004T亲缘关系最近，相似性达100%；MX2、MX5 和 MX8 均属于根瘤菌属。菌株MX3 和MX9 处于同一个小分支，与参比菌株B.cytisi CTAW11T相似性达 99%，MX6 与参比菌株 B.pachyrhizi PAC 48T相似性达 99%，MX7 与参比菌株B.daqingense CCBAU 15774T的相似性达 99%；MX3、MX6、MX7 和MX9 属于慢生根瘤菌属。

2.3 持家基因序列系统发育分析

图1 苜蓿根瘤菌16S rRNA 基因的系统发育树Figure 1 Phylogenetic tree of 16S rRNA genes for the alfalfa nodulating rhizobia

对 9 株菌的持家基因（atpD、rpoB 和 glnII）进行测序，用MEGA7.0 的最大似然法对9 株菌和标准菌株进行比对，构建持家基因3 个点位（atpD、rpoB和glnII）联合系统发育树（图2），结果表明9 个菌株在属种的分类结果与16S rRNA 基因序列系统进化结果一致。中华根瘤菌属MX1 和MX4 与参比菌株S.meliloti IAM 12611T距离最近；根瘤菌属中MX2与MX5 与参比菌株R.radiobacter HAMBI 1814T距离最近，MX8 与参比菌株R.leguminosarum ATCC 10004T距离最近；慢生根瘤菌属中MX3 和MX9 与参比菌株B.cytisi LMG 25866T距离最近，MX6 与参比菌株B.pachyrhizi PAC 48T距离最近，MX7 与参比菌株B.daqingense CCBAU 15774T距离最近。因此，根据种水平内16S rRNA 基因同源性应大于或等于97%的标准[16]，并结合持家基因的系统进化地位，将 MX1 和 MX4 鉴定为 S.meliloti，MX2 和 MX5 鉴定为R.radiobacter，MX8 鉴定为R.leguminosarum，MX3 和 MX9 鉴定为 B.cytisi，MX6 鉴定为 B.pachyrhizi，MX7 鉴定为 B.daqingense。

图2 苜蓿根瘤菌持家基因（atpD-rpoB-glnII）的系统发育树Figure 2 Phylogenetic tree of housekeeping genes （atpD-rpoB-glnII ） for the rhizobia nodulating alfalfa

2.4 根瘤菌回接试验分析

为筛选出高效固氮根瘤菌，将捕获到的苜蓿根瘤菌回接于苜蓿根际中，结果表明9 株菌都表现出对苜蓿的促生作用，不同菌株对苜蓿的影响差异较大（表1）。对苜蓿株高影响最大的菌株依次为 MX9、MX3、MX1，株高分别比对照高 27.0%、29.9%、33.9%，对苜蓿根长影响最大的菌株依次为MX1、MX9、MX7，分别比对照高 61.7%、89.4%、93.9%；对生物量影响最大的菌株依次为MX6、MX9、MX7，分别比对照高89.2%、103.4%、139.0%，其中MX7对苜蓿生物量的增加效果和添加N 元素的对照组效果相近。9 株菌和未接种根瘤菌的对照组中苜蓿均有结瘤，苜蓿根瘤菌共生体系与不添加N 元素的对照相比，含氮量有明显提高。对含氮量提高最为显著的 3 株菌分别为 MX9、MX7、MX8，较对照组分别提高182.4%、205.9%、270.6%。其中添加苜蓿根瘤菌MX8 的处理含氮量提高效果最为显著，达到了6.3 g/kg，较添加N 元素的对照组相比，差距最小。结合苜蓿的生长状况和氮含量筛选出苜蓿促生效果好的3 株根瘤菌MX1、MX7 和MX8。

表1 苜蓿生长指标及含氮量Table 1 The growth indexes and nitrogen content of alfalfa

3 讨论与结论

重金属毒性和土壤肥力差是限制植物在重金属污染土壤中生长的主要因子，因此矿区生态恢复的关键在于增强植物的耐受性和提高土壤肥力[17]。苜蓿是一种在我国广泛种植的优质豆科牧草，它与根瘤菌形成的共生体系能有效固氮，提高苜蓿的含氮量和抗逆性[18]，其在复合重金属污染土壤中有较好的修复效果，对土壤中重金属具有富集潜力[19]。

攀枝花矿区土壤含有多种金属元素，但根瘤菌资源丰富。据报道，攀枝花钒钛磁铁尾矿土壤中有与豆科植物水黄皮、大豆、豇豆共生结瘤固氮的根瘤菌属、苍白杆菌属（Ochrobactrum）、慢生根瘤菌属等[20-21]。本研究通过盆栽捕获试验从攀枝花钒钛磁铁尾矿土壤中分离到9 株苜蓿根瘤菌，利用16S rRNA 和持家基因的系统进化分析确定根瘤菌的分类地位。16S rRNA 基因保守性较高，其系统发育树离散程度较小，一般只能确定到属水平[22]；持家基因与16S rRNA 基因相比具有更高的序列差异性，同时具有作为进化信号的相对保守性，因此持家基因的多序列位点分析常用于确定种群关系[23]。本研究中9 株根瘤菌的16S rRNA 基因和持家基因的系统进化分析中分类结果基本一致，通过将种水平内菌株的16S rRNA 基因相似性等于或大于97%作为标准，并结合相对保守的持家基因系统进化分析，明确了攀枝花钒钛磁铁尾矿土壤中的苜蓿根瘤菌系统进化地位。因此，将其分别鉴定为根瘤菌属、慢生根瘤菌属和中华根瘤菌属，说明攀枝花钒钛磁铁尾矿土壤中存在丰富的豆科植物共生根瘤菌资源，其遗传性丰富多样。

苜蓿共生根瘤菌主要集中在中华根瘤菌属，也有少数环境中能分离到与苜蓿共生的根瘤菌属和慢生根瘤菌属[24-26]。本研究从攀枝花钒钛磁铁尾矿土壤中捕获分离到与苜蓿共生的根瘤菌属、慢生根瘤菌属和中华根瘤菌属，说明攀枝花钒钛磁铁尾矿土壤中含有丰富的苜蓿共生根瘤菌，也说明根瘤菌与豆科植物的共生关系会因地域土壤环境差异而不同[27]。虽然苜蓿根瘤中能分离出根瘤菌R.radiobacter和R.leguminosarum，但其均不能与苜蓿共生结瘤[28-29]，说明根瘤中存在非共生根瘤菌，同时也说明根瘤菌与苜蓿共生具有较高的选择性[30]。本研究从攀枝花钒钛磁铁尾矿土壤中分离出的9 株根瘤菌均能与苜蓿共生结瘤固氮且表现出较强的促生能力，说明钒钛磁铁矿区土壤中的土著根瘤菌具有较好的共生特性[31]，钒钛磁铁尾矿土壤中丰富多样的土著苜蓿共生固氮根瘤菌，可使强化矿区重金属污染土壤的苜蓿修复效果成为可能。

根瘤菌与豆科植物共生固氮影响植株氮含量、干重、生长状况等多项指标[32]。本研究筛选获得的高效共生固氮根瘤菌MX1、MX7 和MX8 也显著影响了苜蓿的氮含量、株高、根长及生物量。其中，R.leguminosarum MX8 使苜蓿植株氮含量达到了6.3 g/kg，较不接菌且不施氮肥的对照植株提高了3 倍，而仅比不接菌且施用氮肥的苜蓿植株低6%，说明MX8能与苜蓿高效共生固氮，其固氮效率与施氮肥接近。虽然S.meliloti MX1 并不能显著提高植株的氮含量，但能显著促进苜蓿的生长，这可能是由于MX1 与苜蓿草共生过程中产生的其他生长因子促进了苜蓿植株的生长；B.daqingense MX7 不仅可以显著提高植株氮含量（其氮含量是不接菌且不施氮肥的3 倍），而且能使植株的株高、根长、生物量显著增加；这说明不同的苜蓿根瘤菌表现出不同的共生固氮效率和促生能力。本研究筛选获得的苜蓿共生根瘤菌为进一步构建苜蓿-根瘤菌联合修复钒钛磁铁矿区土壤的技术体系提供可利用的根瘤菌资源。

攀枝花钒钛磁铁尾矿土壤中的苜蓿共生根瘤菌丰富多样，主要包括中华根瘤菌属、根瘤菌属和慢生根瘤菌属，分离筛选出的S.meliloti MX1、B.daqingense MX7 和R.leguminosarum MX8 对苜蓿表现出较强的促生能力，其能显著提高苜蓿的氮含量、株高、根长和生物量，为进一步应用于钒钛磁铁矿尾矿土壤的苜蓿-根瘤菌联合修复提供可利用的菌株资源，但苜蓿与根瘤菌联合修复钒钛磁铁尾矿土壤效率还有待进一步研究。