细胞（蜡）块联合免疫细胞化学技术通过胸腔积液检测诊断恶性肿瘤的价值

王占东，卓 静，李 菲，缪晓丹，王 涛，时 瑶

胸腔积液是晚期恶性肿瘤患者常见的临床并发症状，临床多采用穿刺抽取积液以减轻症状，并进行常规细胞学检查。大多数病例会得到明确诊断，但对于原发灶不明、无法通过内镜活检、体外穿刺及手术切除获得组织标本的病例，胸腔积液细胞病理学诊断可能是这类患者能确诊的选择方法。传统涂片明显不能满足要求，临床迫切需要从胸腔积液获得明确诊断，采取精准治疗，因此胸腔积液进行细胞蜡块结合免疫细胞化学技术检测应运而生，并迅速发展，笔者收集近两年的病例，进行回顾性总结。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2017年1月—2018年12月徐州市肿瘤医院收治的406例胸腔积液患者作为观察对象，所有患者均经过该院影像学诊断、穿刺确诊为胸腔积液患者；所有患者均进行传统涂片细胞学检查，其中阴性161例、仅见少许异型细胞38例，高度可疑癌36例，发现癌细胞164例，其他恶性肿瘤7例。其中56例诊断不明确或已诊断为癌而临床需要进一步分型的患者，进行细胞蜡块及免疫细胞化学技术检测。

1.2方法

1.2.1传统涂片制作方法 采集患者浆膜腔积液标本 200～500 ml，迅速送往细胞室。 取出 20 ml，置离心管中，2000 r/min，离心10 min，弃去上清，取出沉渣，采用推拉法制片2张/例，待其自然风干之后，使用瑞特-吉姆萨双染色法进行染色处理。

1.2.2细胞块制作方法 把剩余的浆膜腔积液，静止后，弃上清，留存50 ml，震荡后移入离心管内，2000 r/min，离心10 min离心两次后离心管中加入10%中性甲醛10 ml，室温固定处理1 h后，弃上清，使用吸管将细胞块放置于显微镜擦镜纸上，包好后放入包埋盒，置于自动脱水机中进行处理，做成石蜡细胞块。进行常规石蜡包埋切片，苏木素-伊红染色，光镜观察。

1.2.3免疫细胞化学采用En Vision法 一抗雌激素受体广谱细胞角蛋白 （pan-cytokeratin，CKpan）、CK5/6、P63、GATA3、Cg-A、Synaptophysin、TTF-1、NapsinA、Calretin、WT-1、MOC-31、BerEP4、Ki-67等均购自北京中杉生物技术有限公司。阳性判断标准：相应部位出现棕黄色颗粒。操作步骤均按说明书进行。

1.3 统计学方法采用SPSS 21.0统计软件处理数据，率采用（%）表示，比较用 χ2检验。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

56例胸腔积液患者，男18例，女38例；年龄25～86岁，中位年龄69岁。传统涂片法查见癌细胞，即阳性37例；未查见癌细胞，即阴性5例；查见异型或可疑癌细胞，即不确定14例。胸腔积液细胞蜡块结合免疫组织化学染色结果显示，阳性47例（包括转移性肺腺癌43例，鳞状细胞癌2例，乳腺癌1例，卵巢浆液性癌1例），阴性9例。其中2例传统涂片诊断为癌，而细胞块加免疫细胞化学证实为增生的间皮细胞，14例不确定者，其中9例证实为癌，5例为阴性。后者阳性检出率高于前者，且不确定构成比低于前者（表1）。两种方法检出率比较，差异有统计学意义（χ2=5.556，P＜0.05），见表 2。

细胞块石蜡切片中转移性肺腺癌细胞常常成团聚集，边缘光滑的三维立体的细胞球最常见，也可以呈梅花状、乳头状和腺腔，核浆比增大，核异型，核染色质细腻（图1），背景可见少许炎细胞，使癌细胞非常突出，或背景夹杂大量增生间皮细胞，与癌细胞不易区别（图2）。造成形态学诊断困难。

表 1 传统涂片与细胞块+免疫细胞化学检出率比较［例（%）］

表 2 两种方法检出率与漏检率比较［例（%）］

免疫细胞化学染色：转移性癌表达广谱细胞角蛋白（pan-cytokeratin，CKpan）、BerEP4，同时转移性肺腺癌细胞 TTF-1（图 3）、NapsinA（图 4）阳性；鳞状细胞癌 CK5/6、P40阳性；乳腺癌 ER、PR及GATA3 阳性；卵巢癌 WT-1、PAX8、CA125 阳性。而增生的间皮细胞表达 CK5/6、Calretin、WT-1等抗体。

图1～4见封三。

3 讨论

胸腔积液是临床常见病症，其良恶性判定对疾病的诊断、治疗及预后有重要的临床意义。如何利用胸腔积液判断是炎症反应、间皮增生、间皮瘤、还是转移性肿瘤，是临床关心的问题，如果能同时判断转移性肿瘤的来源及类型，亦是临床诊断及治疗的需要。胸腔积液离心后制成细胞涂片，进行细胞学诊断是最常用的方法，已开展多年，也解决了很多实际问题，但尚不能满足需要，免疫组织化学是外科组织病理学最常用的诊断技术，其结果有助于确诊肿瘤的良恶性、组织来源及组织亚型。如何把免疫组织化学应用于细胞学，现在有多种方法，其一是细胞涂片退染后，免疫细胞化学染色；其二采用同时制备多张涂片进行免疫细胞化学染色的方式；还有一种就是现在逐渐被认可并用于实际工作的细胞块加免疫细胞化学技术方法［1-3］。

细胞块（cell block，CB）制备是指将细胞悬浮液离心，得到高度浓缩的细胞和微小的组织块，再经由固定、脱水、透蜡和石蜡包埋等操作后得到的可长期保存的细胞蜡块。现在常见的细胞块制备方法主要有直接法（离心管沉淀制备法、冷冻细胞团蜡块制备法、试管包埋法、载玻片细胞聚集制备法）和间接法（琼脂细胞块制备法、蛋清细胞块制备法、凝血酶一血浆细胞块制备法、HistoGel制备法、Collodion bag（ColB）制备法）［4］，笔者采用了最简单直接的离心沉淀法，富集有核细胞层制备细胞块，具有细胞数量较多，背景清晰，染色鲜艳，核浆对比清晰，组织结构也保存得比较完整等优点［5］。同时细胞块易于保存，可连续切片，便于进行免疫细胞化学染色，其免疫细胞化学染色背景清晰，着色均匀，阳性定位准确，显色明确，资料可长期保存，使细胞学具有组织病理学的特点［6］。如有需要还可以进行基因检测［7］。

胸腔积液需要确定是炎症反应，间皮瘤，还是转移性肿瘤，因此需要一组标志物，进行鉴别诊断，常 用 的 是 CK （pan）、CK5/6、P63、GATA3、Cg-A、Synaptophysin、TTF -1、NapsinA、Calretin、WT -1、MOC-31、BerEP4、Ki-67等多种抗体标志。对于胸腔积液中常见的转移性肺腺癌CK （pan）、TTF-1、NapsinA 是常用的标志物［8］，鳞状细胞癌 CK5/6、P40阳性；乳腺癌ER、PR及GATA3阳性；卵巢癌WT-1、PAX8、CA125阳性。而增生的间皮细胞表达CK5/6、Calretin、WT-1 等 抗 体 。 其 中 WT-1（Wilm’s tumor gene）在增生间皮细胞、间皮瘤及转移性卵巢浆液性癌中呈核阳性，转移性恶性黑色素瘤胞浆阳性。而组织细胞、淋巴细胞、转移性肺腺癌、乳腺癌、胃癌等呈阴性［9］。CK（pan）在间皮与癌细胞均有表达，需要 Calretin、WT-1、MOC-31、BerEP4 等多种抗体联合应用，才能鉴别诊断。该组病例，未见报道中的恶性黑色素瘤，淋巴瘤，如有需要，应用于组织蜡块的免疫细胞化学抗体，在细胞块中也适用。

该实验结果显示，细胞块结合免疫细胞化学技术方法对于胸腔积液的阳性检出率明显高于传统涂片，且对于转移癌能进一步明确来源及类型，细胞块具有可长期保存的优势，因此细胞块结合免疫细胞化学技术方法对于提高细胞学诊断准确性有很大帮助，应用于宫颈及非妇科液基细胞学的细胞块结合免疫细胞化学技术方法已有报道［10］，不断总结经验，提高细胞学诊断水平。