痘病毒宿主范围因子研究进展

成温玉，贾怀杰，景志忠

痘病毒作为一类广泛存在的病原，多数成员能够感染人和多种动物且能引起死亡。隶属正痘病毒属的天花病毒(Variola virus, VARV)曾在人类历史上造成数以万计人的死亡。作为天花疫苗的痘苗病毒(Vaccinia virus, VACV)，成功应用于消灭天花的疫苗接种运动，为人类免疫学的发展奠定了伟大的基础。1980年WHO向世界宣布：已在世界范围内彻底消灭了天花，自此全世界各个国家或地区陆续停止了天花疫苗接种。然而，由于天花疫苗接种的终止和恐怖主义的威胁，以及一些痘病毒的宿主范围和疫源地的不断扩大，使得处于免疫空白状态的人和动物随时面临痘病毒的威胁。2003年猴痘在美国中西部的的出现，再次为世人敲响了警钟，尤其是美国、日本等国家，加强天花疫苗的改良和战略储备[1]。此外，2014年7月在美国华盛顿某实验室的储藏室发现保存的天花病毒样本，以及恐怖主义拟利用痘病毒作为生化武器，再次引起人们的警觉[2-3]。据统计，目前在隶属痘病毒科脊索动物痘病毒亚科10个属中超过10种痘病毒都具有感染人的能力，其中的猴痘最有可能引发大规模的疫情，且与天花的临床症状尤为相似[4]。因此，本文从痘病毒基因组出发，对多种痘病毒的宿主范围基因及其编码蛋白进行总结，从而加深对病毒的认识和跨种感染机制的理解。

1 痘病毒宿主范围因子

痘病毒是已知病毒粒子中体积最大、结构最复杂的双链DNA病毒，于宿主细胞胞质中完成基因组的复制。痘病毒拥有大量基因组，在不同种属间130～375 kbp的序列中包含多达328个开放阅读框(Open Reading Frames, ORFs)。痘病毒基因组序列分析表明，在位于基因组中间约100 kbp的核苷酸序列在所有痘病毒中高度保守，两端存在多个高变的反向重复序列(Inverted Terminal Repeats, ITRs)，大小0.1～13 kbp，而在多数痘病毒成员中，ITRs中又包含许多复制基因[3]。

痘病毒的成员表现出不同的宿主范围，即使在同一属中亲缘关系较近的种间，其宿主范围具有很大的差异。如正痘病毒属的VARV仅感染人，而同属的牛痘病毒(Cowpox virus, CPXV)和猴痘病毒(Monkeypox virus, MPXV)却能感染许多种哺乳动物，具有相对广泛的宿主谱。此外，多数痘病毒能够感染不同动物细胞，而有些却只能入侵部分特定的细胞系。而这些现象都是基于痘病毒在演化过程中，在宿主范围上形成的病毒特异性差异基因，被称作宿主范围基因(Host range genes，Hrg)[5]。目前已经证实，在不同的痘病毒中至少有16个基因具有宿主范围的功能(见表1)，人为敲除这些基因可造成病毒在易感细胞中的复制缺陷。

表1 痘病毒宿主范围基因[5-6]
Tab.1 Poxvirus host range genes[5-6]

2 痘病毒宿主范围因子家族

2.1PKR抑制因子K3L和E3L 宿主双链RNA依赖性蛋白激酶PKR受多种病毒的感染激活，通过真核翻译起始因子2(eukaryotic translation initiation factor 2, eIF2)α亚基的磷酸化发挥抗病毒反应。经过长期进化，多数病毒形成了抑制PKR抗病毒的能力[7]。VACV具有2个PKR抑制因子：K3L和E3L，且在许多痘病毒中都含有K3L和E3L蛋白同系物。K3L属于PKR的一个非磷酸化的假底物，与eIF2α N末端S1域同源，能够结合到活化的PKR催化域，使PKR第446位的丝氨酸磷酸化，进而抑制PKR结合到作用靶点，同时抑制PKR二次自磷酸化[7-8]，从而抑制了机体干扰素(interferons, IFNs)的抗病毒反应。K3L缺失的VACV(VACVΔK3L)在鼠L929细胞和BHK细胞中出现增殖障碍，而在Hela细胞和兔RK13细胞中却能正常增殖。在其他正痘病毒中，鼠痘病毒(Ectromelia virus, ECTV)和MPXV的基因组中不含有K3L的同系物。核苷酸序列分析发现，ECTV第94位有一个T插入造成氨基酸移码突变使得该基因翻译提前终止。而在MPXV的序列中也出现类似的情况，序列第130～132处形成终止密码子引起翻译提前终止，使得抑制PKR重要的氨基酸基序(KGYID)无法表达[5]。

E3L也是PKR的抑制因子，通过抑制宿主双链诱导性PKR的激活和宿主双链结合蛋白发挥抗宿主免疫反应。VACV编码的E3L蛋白包含N端Z-DNA结合结构域(Z-DNA binding domain, ZBD)和C端双链RNA结合结构域(dsRNA-bindin domain, dsRBD)。dsRBD通过抑制dsRNA激活因子以及直接结合PKR激酶阻断PKR的激活，而ZBD则通过反向作用于PKR的报告基因发挥功能[9-10]。细胞感染实验表明，人为敲除E3L基因影响VACV在Hela、Vero和L929细胞的增殖，但在儿童成纤维细胞、BHK和RK13中的复制无影响。另外，缺失基因E3L基因的VACV其宿主范围比缺失K3L基因的突变株广，表明E3L和K3L在决定的宿主范围方面存在差异。除了MPXV、粘液瘤病毒(Myxoma virus, MYXV)和兔纤维瘤病毒(Rabbit fibroma virus, RFV)之外，已知序列的所有痘病毒均含有E3L同源序列[11]。MPXV的序列分析表明，所有正痘病毒属E3L起始密码子ATG在MPXV中突变为ATT，使得其大大降低了E3L起始翻译效率。此外，与VACV E3L序列相比较，MPXV在第50/51 和 第72/73分别出现2个碱基的缺失，从而引起E3L的移码突变[5]。

2.2C7L/M063R家族和T2/Crm家族 C7L是痘病毒基因组中一个大的超家族，所有已知全基因组的痘病毒都含有C7L家族成员。C7L影响病毒对哺乳动物的细胞嗜性，尤其对部分痘病毒的整个生命周期至关重要。VACV C7L通过抑制eIF2α的磷酸化拮抗dsRNA激活的蛋白激酶通路，与K1L作用互补[12]。保留K1L和C7L阅读框的减毒性VACV证实，C7L具有抑制细胞凋亡的功能[12-13]。此外，Meng等人敲除K1L后，证实VACV C7L具有拮抗IFNs介导的抗病毒作用[14]。MYXV含有C7L的同源序列M062R、M063R和M064R，敲除试验证实，M063R的缺失影响病毒在兔源细胞系的复制，而M062R缺失影响其在BGMK、RK13、RL-5和人源细胞中的复制[15-16]。经重组病毒研究表明，重组M062R的VACV株(C7L和K1L缺失性)可以拯救其在鼠3T3、Hela和A431细胞中的复制，而M063R和M064R却无法实现，表明三者在决定病毒的细胞嗜性方面存在差异[17]。

部分痘病毒表达的T2因子属于肿瘤坏死因子受体(Receptors for tumor necrosis factor, TNFR)的同系物，具有4个N端半胱氨酸富集域(cysteine rich domains, CRDs)和1个特异性参与T2分泌的C端，CRDs序列与TNFR-2高度同源，能够中和肿瘤坏死因子和阻断细胞凋亡[5]。敲除T2的MYXV在对欧洲兔致病力显著降低，同时在兔RL-5细胞中出现复制缺陷。与T2同源的其它痘病毒蛋白被称作细胞因子应答修饰物(cytokine response modifiers， Crm)，其中CPXV 编码CrmB、CrmC、CrmD和CrmE，ECTV仅表达CrmD，MPXV和VACV仅编码CrmB，而VACV WR、DryVax(Wyeth)和Tian-Tan株均不表达Crm[3]。序列分析发现，这些不编码Crm的痘病毒都是由于在其进化过程中DNA序列出现碱基的插入或缺失而破坏了相应的ORF所造成的[5]。

2.3T4家族和M11L/F1L家族 细胞凋亡是宿主阻止病原感染的一种重要的防御机制，而病原在长期的进化中也形成了与其相对应的抵抗机制。痘病毒编码25 kDa的T4蛋白具有抑制宿主细胞凋亡的能力，属于内质网定位的凋亡抑制因子。缺失T4基因的MYXV能够在RK13细胞中正常复制，而在兔RL15细胞和外周血淋巴细胞中复制受到影响，同时对欧洲兔的致病力明显减弱。所有野兔痘病毒属、山羊痘病毒属和鹿痘病毒属的成员均含有T4同源序列，在ITRs区存在2个相同的拷贝[5]。而在部分正痘病毒属中，如CPXV-BR 株、CPXV-GRI株、骆驼痘病毒(Camelpox virus, CMLV)、沙鼠痘病毒(Taterapox virus, TATV)和MPXV仅存在单个序列拷贝。ECTV和VACV不含T4同源序列[3]。

MYXV表达另一种抗凋亡蛋白——M11L，定位于线粒体上，发挥拮抗细胞凋亡作用。与M11L同源的VACV F1L都是通过阻断凋亡分子Bax和Bak发挥抗凋亡功能[18]。近期的一项研究表明，F1L还能够抑制NLR(Nucleotide-binding domain, Leucine-rich repeat and Pyrin domain containing protein)家族成员NLRP1以增强病毒的致病性[19]。M11L和 F1L蛋白在结构上与宿主细胞表达的Bcl蛋白家族相似，都具有类似于BclX1蛋白折叠的结构[20]。M11L缺失的MYXV毒株在兔RK13细胞中正常复制，而在兔脾细胞中增殖受限，且对兔的致病力明显降低。序列分析表明，正痘病毒属、野兔痘病毒属、山羊痘病毒属以及猪痘病毒(Swinepox virus, SWPV)都包含M11L/F1L基因[5]。

2.4M13L家族和Serpin家族 MYXV M13L编码一个包含热蛋白结构域(Pyrin domain, PYD)、大小为125个氨基酸残基的蛋白，在人THP-1细胞中抑制caspase-1的激活[3]。Rahman等人的研究发现，MYXV和RFV表达的M13L都直接作用于含PYD的蛋白ASC-1，从而影响机体IL-1β和IL-18对病原的应答[21]。M13L缺陷性病毒在兔RK13细胞中存在复制障碍，而在RL5细胞、原代血液单核细胞和淋巴细胞中没有影响[5]。RFV、SWPV、鹿痘病毒(Deerpox virus, DPV)和塔纳痘病毒(Tanapox virus, TPV)都含有M13L，而在山羊痘病毒属的成员以及亚巴猴肿瘤病毒(Yaba monkey tumor virus, YMTV)的基因组中缺失。遗传发育分析表明，二者无直接的亲缘关系，这很可能是其在独立进化过程中发生基因重组的结果。

Serpin属于丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serine protease inhibitors，SPI)，在炎症反应、细胞凋亡和补体激活等生物学反应调控中发挥重要的作用。多数痘病毒表达serpin，阻碍宿主对病原的应答。正痘病毒属中存在的SPI-1、SPI-2和SPI-3三种serpin，分别特异性地作用于不同的宿主靶点：SPI-1 作用于组蛋白酶G(cathepsin G)；SPI-2作用于caspases 1、caspases 8、caspases 10 以及颗粒酶B(granzyme B)；SPI-3作用于纤溶酶原激活物和胞浆素以及凝血酶[3,5,22]。Melo-Silva等人证实，ECTV SPI-2蛋白是一种毒力因子，不仅抑制caspases 1和caspases 8的功能，而且阻碍NK细胞对病原的应答[22]。SPI-1缺陷性兔痘病毒(Rabbitpox virus, RPXV)在猪PK细胞和人A549细胞中存在复制缺陷，而在其它细胞中正常复制。同样SPI-1缺陷性VACV-WR在A549细胞和人的角质细胞不能增殖，但在非洲绿猴BSC-1细胞中正常增殖。序列分析发现，所有正痘病毒都含有SPI-1、SPI-2和SPI-3同源序列，而羊痘病毒属、YMTV、RFV、和SWPV仅含1个serpin基因，YLDV和TPV含2个serpin基因[5,23]。

2.5B5R家族和p28/N1R家族 B5R是胞外病毒粒子包膜的重要蛋白成分之一，包括4个串联排列的短补体样重复结构域(Short complement-like repeats, SCRs)和1个C端跨膜结构域(Transmembrane domain, TM)，4个SCRs包含近60个氨基酸序列，而这些序列也存在于补体系统蛋白中[5]。B5R敲除的VACV(VACVΔB5R)形成胞外包裹病毒粒子(Extracellular enveloped virions，EEV)受阻，同时影响病毒粒子的毒力[24]。B5R缺陷性VACV LC16m8株在Vero细胞中存在复制缺陷，而在兔RK13细胞中无影响。敲除B5R基因的RPXV(RPXVΔB5R)在兔RK13、Rat2和非洲绿猴CV-1等细胞中病毒噬斑减少，且在Vero、PK-15和鸡胚成纤维细胞中无法形成病毒噬斑。序列分析表明，禽痘病毒属和副痘病毒属无B5R相关基因，而在MYXV、SWPV、山羊痘病毒(Goatpox virus, GTPV)和绵羊痘病毒(Sheeppox virus, SPPV)的序列中存在的B5R相关基因，而且其表达物仅包含2个SCRs和1个C端跨膜结构域(见图1)。

图1 B5R家族的基因结构Fig.1 Structure of the B5R family

ECTV p28和RFV N1R是一类N端含有KilA-N和C端含有RING锌指结构域的痘病毒特异性泛素连接酶蛋白，在多种痘病毒中高度保守[25]。ECTV编码的p28蛋白是病毒重要的毒力因子，p28基因敲除的毒株在鼠巨噬细胞中丧失复制能力。Mottet等人的研究发现，p28作为一种泛素连接酶，通过KilA-N结构域连接泛素蛋白定位于“病毒工厂”，并受泛素化作用和蛋白酶体降解机制的调节[26]。RFV表达p28的同系物N1R，与p28有相同的结构，具有抑制细胞凋亡的功能。序列分析发现，多数正痘病毒属成员都具有p28同源序列，而禽痘病毒含有2个p28同原序列的拷贝(见表2)。

2.6ANK/F-box家族和K1L家族 许多胞内蛋白都包含多拷贝的锚蛋白重复(Ankyrin repeats, ANK)域以调节蛋白与蛋白间的相互作用。在痘病毒编码的蛋白中，含ANK结构域的蛋白形成了一个巨大家族且多数C端存在F-box样结构域[27]。目前，CPXV编码的CP77蛋白和MYXV编码的T5蛋白都属于ANK/F-box蛋白，被鉴定为痘病毒的宿主范围因子。CP77能够拯救VACV在CHO细胞中的复制，而在未插入CP77基因的情况下，VACV因无法合成早期蛋白而丧失在CHO细胞中的复制功能[5]。CP77也能使缺失同源基因的ECTV在仓鼠CHO细胞、兔RK13和SIRC细胞等低复制效率的细胞系中提高复制效率[28]。Chang等人在探讨CP77的作用机理时发现，CP77蛋白通过ANK和F-box样结构域分别结合到NF-κB的p65亚基和胞内SCF连接酶复合物抑制TNFα对NF-κB激活[29]。MYXV编码的ANK/F-box蛋白T5作为毒力因子，对病毒的感染能力至关重要。T5基因敲除MYXV(MYXVΔT5)在RL5细胞、兔外周单核细胞和人源肿瘤细胞中存在复制障碍，但在RK13细胞中却能正常复制。T5能够结合到丝/苏氨酸激酶Akt并促进其磷酸化和激活，而在MYXVΔT5感染的细胞中Akt磷酸化水平显著降低，且病毒的滴度明显减少[30]。基因组序列发现，痘病毒拥有大量的ANK/F-box蛋白编码基因，其中禽痘病毒属中的金丝雀痘病毒(Canarypox virus, CNPV)最多含有35个拷贝，其它重要痘病毒也存在多个拷贝(见表2)。

正痘病毒属的痘病毒存在另一种含ANK结构域但缺少F-box的宿主范围因子——K1L。缺失K1L基因的VACV-COP株丧失了在兔RK13细胞中的复制能力，但在人MRC-5、Vero和猪LLC-PK1细胞中复制能力不受影响[31]。被改造的VACV-Ankara株因缺失K1L基因而毒力大大减弱，而重新插入K1L基因后，能恢复其在RK13细胞中的增殖能力。VACVΔK1L在RK13细胞中病毒的蛋白合成终止，重构的K1L VACV-Ankara株通过抑制IκBα的降解进而阻断NK-κB信号通路的激活，而VACV-WRΔK1L株却能激活NK-κB通路，表明除了K1L外，其他的病毒蛋白也参与NK-κB通路的调节。除了VARV和CMLV，正痘病毒属的其它成员都拥有完整的K1L同源序列[32]。早熟终止密码子的出现和碱基的缺失或插入是引起VARV和CMLV K1L基因失活的关键，因此，遗传发育分析显示，二者形成一个独立的进化分枝。

表2 痘病毒基因组中存在宿主范围基因的概况[5]
Tab.2 Summary of presence of host range genes in poxvirus genomes[5]

TNFR familyserpinsC7LfamilyE3LK3LCrmBCrmCCrmDCrmET2P28-likeSPI-1SPI-2SPI-3F1L/M11LC7LM63RT4B5RK1LANK/F-boxVariola virus (VARV)11111111114Vaccinia virus WR (VACV-WR)111211111Cowpox virus GRI-90 (CPXV-BR)11111111111111110Monkeypox virus Zaire (MPXV)111111111116Ectromelia virus (ECTV)11111111114Camelpox virus (CMLV)11111111114Taterapox virus (TATV)11111111113Orf virus (ORFV)15Sheeppox virus (SPPX)111【1】1114Goatpox virus (GTPV)111【1】1114Swinepox virus (SWPV)111【1】114Deerpox virus (DPV)111【2】111115Tanapox virus (TPV)111【1】11114Yaba monkey tumor virus (YMTV)111【1】114Rabbitpox virus (RPXV)111111111114Myxoma virus (MYXV)1111【2】11114Rabbit fibroma virus (RFV)1111【1】1113Canarypox virus (CNPV)2【4】35Fowlpox virus (FPV)2【4】19

注：“【】”表示进化过程中产生的与宿主范围基因关联性的相关基因。

3 小结与展望

相对于其他病毒而言，痘病毒基因组庞大，编码多种蛋白，使得其在宿主细胞的胞质中就能完成基因组复制。在多数痘病毒基因中，约有100个基因特别保守，这近百个基因对于病毒的复制和成熟至关重要，而其他的基因则较为分歧，位于基因组两端的ITRs区，主要参与宿主致病、免疫调节以及决定感染宿主的范围。痘病毒的嗜性是其主要的特性，也是人们的研究热点。这种嗜性不仅受病毒自身编码的宿主范围因子决定，也涉及到病原与宿主间的相互作用。研究发现，痘病毒嗜性至少取决于3个层次：①细胞嗜性。病毒在不同的细胞系上表现出不同的复制能力；②组织器官的嗜性；③生物个体的嗜性。病毒在受到细胞和组织器官嗜性的影响以及宿主机体免疫应答的影响后，显现出致病性和症状的差异性[3,33]。几乎所有的痘病毒都能结合并入侵哺乳动物细胞，其入胞后下游的一系列胞内事件决定了病毒复制的限制性[34-35]。总之，痘病毒宿主范围和嗜性不仅受其自身编码的宿主范围因子决定，而且取决于病原与宿主的相互作用。

痘病毒是一种古老的病毒，经历了漫长的演化过程。起初VARV被认为只感染动物，后来经过不断进化到只感染人，同时缺乏存储宿主，这也是消灭天花的关键。整体上看，痘病毒的宿主范围表现出由窄到宽的趋势，先前有些认为不具人畜共患性的成员，当前表现出感染人的趋势，而有些只感染几种宿主，当前却能感染多种宿主。因此，加强痘病毒的研究，发掘其庞大基因组中潜在的功能基因，通过不同种属病毒对比，预测其进化趋势，对于痘病毒的预防和消灭至关重要；应用高通量测序技术，探究病毒与宿主相互作用机制，重视痘病毒宿主谱的监测，加深我们对痘病毒致病机制、进化方式的认识和理解，从而更好地预防痘病疫情，避免类似SARS这种因人类忽视而暴发严重的疾病。同时充分利用痘病毒自身生物学特性，通过人为改造等方式为人所用，研制类似于天花疫苗的重组痘病毒或载体疫苗，为痘病毒及其他病原体的所引发的疫病有效防控具有积极的意义。

利益冲突：无