分离自儿科患者肺炎克雷伯菌的常见碳青霉烯酶基因检测

刘婧娴， 李媛睿， 阿旺穷吉， 刘 瑛

肺炎克雷伯菌是导致医院感染的最常见的条件致病菌之一。近年来，随着临床上碳青霉烯类抗生素的广泛应用，耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌（CRE）分离率逐年增加，据2014年CHINET中国细菌耐药性监测数据显示肠杆菌科细菌中CRE的分离率逐年上升，其中耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）上升尤为显著[1]。CRKP所引起的感染性疾病具有高发病率和高病死率等特点。由于儿童患者的自身免疫力较低更容易感染CRKP，而此类菌株通常呈多重耐药，这给临床抗感染治疗带来了极大的挑战。本研究通过探讨上海交通大学医学院附属新华医院儿科患者CRKP的耐药机制，以期为治疗儿科患者CRKP感染提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 收集2010年1月-2016年12月从我院儿科患者临床标本中分离到的非重复CRKP 197株，菌株接种于甘油肉汤，-80 ℃保存。质控菌株大肠埃希菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853和肺炎克雷伯菌ATCC 700603，均由上海市临床检验中心提供。产KPC-2酶肺炎克雷伯菌（LYKPC）由上海市第六人民医院检验科惠赠。产IMP、VIM酶铜绿假单胞菌（RJIMP、RJVIM）由上海瑞金医院微生物科惠赠，产NDM-1及产OXA-232肺炎克雷伯菌为本实验室曾经分离并通过基因测序确定为携带相应基因的菌株。

1.1.2 主要试剂和仪器 血平皿、麦康凯平皿、巧克力平皿、选择性巧克力平皿和MH平皿均购自上海伊华生物技术有限公司，LB肉汤培养基购自美国Invitrogen公司，α-氰基-4-羟基肉桂酸（HCCA）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）购自德国Bruker Dahonik公司，VITEK 2-Compact全自动微生物分析系统、菌种鉴定卡（GNI）和药敏鉴定卡（GNl3）购自法国Bio Mérieux公司，亚胺培南、美罗培南、厄他培南药敏纸片购自英国OXOID公司，PCR仪购自德国Eppendorf公司，水平电泳仪及凝胶成像系统购自上海天能科技有限公司，PCR扩增试剂盒购自上海生工生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株鉴定 菌株复苏后采用MALDI-TOF MS重新鉴定复核，鉴定结果与原始VITEK 2-Compact全自动微生物分析系统鉴定结果一致的菌株纳入本研究。

1.2.2 药物敏感性试验 采用VITEK 2-Compact全自动微生物分析系统联合纸片扩散法对菌株重新进行药敏试验，包括氨苄西林、头孢唑林、头孢美唑、头孢呋辛钠、头孢替坦、头孢曲松、头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟、氨曲南、氨苄西林-舒巴坦、头孢哌酮-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦、亚胺培南、美罗培南、厄他培南、妥布霉素、庆大霉素、阿米卡星、 左氧氟沙星、环丙沙星、甲氧苄啶-磺胺甲唑等。按照2017年CLSI标准判读药敏结果[2]。对美罗培南、亚胺培南和厄他培南等碳青霉烯类抗生素一种或一种以上耐药的菌株定义为CRKP[3]。

1.2.3 PCR扩增及测序 煮沸法提取细菌总DNA作为PCR反应模板[4]。PCR方法扩增blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaVIM、blaGES、blaOXA等常见碳青霉烯酶基因[4]。引物序列、反应体系及扩增条件参照文献 [4]。反应结束后将扩增产物加入1.5%琼脂糖凝胶的加样槽中，120 V/cm条件下电泳40 min。电泳结束后将琼脂糖凝胶置于紫外凝胶成像仪中观察结果并摄片。PCR阳性产物送上海生工生物工程有限公司采用Sanger法进行测序。

1.2.4 菌株临床资料 收集菌株标本来源、分离时间、科室分布，以及菌株对应患者的临床信息，结合实验结果进行统计分析。

2 结果

2.1 鉴定及药敏结果

2010年1月-2016年12月儿科患者临床标本中共收集到197株CRKP，采用MALDI-TOF MS复核鉴定结果均为肺炎克雷伯菌。197株CRKP对亚胺培南、美罗培南和厄他培南的耐药率分别为93.4%、96.0%和100%，对大部分头孢菌素类药物耐药率达100%，个别菌株对头孢美唑、头孢替坦和头孢吡肟以及β内酰胺类酶抑制剂复合制剂保持敏感。CRKP菌株对喹诺酮类的耐药率也较高，如左氧氟沙星、环丙沙星耐药率分别为61.4%和62.4%，对氨基糖苷类药物以及甲氧苄啶-磺胺甲唑仍保持较高的敏感率。见表1。

表1 分离自儿科患者CRKP对抗菌药物的敏感率和耐药率Table 1 Susceptibility of carbapenem-resistant K. pneumoniae isolated from pediatric patients to antimicrobial agents（%）

2.2 碳青霉烯类耐药基因PCR扩增检测结果

PCR及测序结果显示，197株CRKP中113株（57.4%）携带KPC-2基因，其次为NDM-5、NDM-1和IMP-4。10株（5.1%）检出2种或2种以上碳青霉烯酶基因，12株（6.1%）未检测到本研究所包含的碳青霉烯酶基因。见表2。

表2 197株CRKP碳青霉烯类耐药基因结果Table 2 Carbapenemase genes identi fied in 197 strains of carbapenem-resistant K. pneumoniae

2.3 临床资料统计结果

197株CRKP中89株（45.2%）取自痰液标本，其次为尿液、分泌物、全血、胸腹水和导管，分别占17.8%（35/197）、12.2%（24/197）、7.6%（15/197）、6.6%（13/197）和4.6%（9/197）。绝大部分CRKP分离自ICU，其次为儿外科和新生儿病区。儿科ICU和儿外科检出的耐药基因以KPC-2为主，而新生儿科检出的则以NDM基因为主（见表3）。197株CRKP分离自163例住院患儿，患儿的平均住院天数为（39±37）d，感染产KPC菌株的患者较感染产NDM菌株的患者平均住院时间稍长，但差异无统计学意义；绝大部分患者为医院获得性感染，占92.6%（151/163）；8.0%（13/163）患者携带CRKP时间大于1个月，CRKP类型多为产KPC酶（8例）和产NDM酶（4例）的菌株；11.0%（18/163）患者多个部位检出CRKP，这些菌株大多携带KPC基因（13例）；84.7%（138/163）患者最终好转出院，13.5%（22/163）患者自动出院，3例死亡。

3 讨论

过去的二十余年，CRKP在全球范围内迅速传播，此类菌株多携带KPC、NDM等碳青霉烯酶基因，表现出对碳青霉烯类抗生素高度耐药，给临床抗感染治疗带来了极大的挑战。近年来，CRKP在儿科患者中的检出率逐渐增高，而儿科患者中分离的CRKP遗传背景与成人有所不同，通常不是当前广泛流行的克隆株[5]。CRKP感染对患儿预后造成的不良影响也亟需引起重视。最近，一项多中心队列研究显示，感染CRE患儿30 d死亡风险明显高于感染碳青霉烯类敏感肠杆菌科细菌（CSE）的患儿[6]。因此，了解儿科患者中CRKP的耐药机制特点，对于有针对性地实施治疗非常重要。

表3 CRKP科室分布Table 3 The distribution of carbapenem-resistant K. pneumoniae by clinical setting

本组资料儿科患者中分离的CRKP最早于2010年检出，2014年以前CRKP呈低水平流行，2014年以后检出数剧增。CRKP的上升趋势与产KPC菌株的检出量呈正相关，2015年开始出现大规模流行，菌株所携带的碳青霉烯酶基因类型丰富多样（见表4）。本研究儿科患者临床标本中的CRKP菌株有57.4%携带KPC-2基因，远高于儿童专科医院2018年22%的报道[7]。本研究共检出27株携带NDM-1基因的CRKP，2014年底产NDM-1肺炎克雷伯菌曾在儿科ICU引起过小规模的暴发流行，随后其他科室也出现播散。2015年5月本院首次从1例儿外科患儿分离到产NDM-5酶CRKP，随后，产NDM-5酶菌株迅速播散，截至2016年其检出数已超过NDM-1菌株。产IMP-4酶菌株出现最早，但未出现流行，其耐药程度较产NDM和KPC酶的菌株低。值得注意的是，本研究还发现10株同时携带2 种或2种以上碳青霉烯酶基因的CRKP，目前在国内有关产多种碳青霉烯酶的相关报道较少。虞涛等[8]在2011年报道了8株同时携带KPC-2及IMP-4基因的菌株在儿童中暴发流行。本研究还检出携带有OXA-232基因的菌株，该基因通常与其他碳青霉烯酶基因，如KPC-2等共存。OXA-232酶属于D 类碳青霉烯酶，大多数对碳青霉烯类水解能力较低，不能水解氨曲南，常与其他耐药机制协同导致细菌耐药。上海地区也曾有在儿科患者中检出携带OXA-232基因CRKP的相关报道[9]。本研究尚有12株菌未检测到耐药基因，推测这些菌株可能携带较少见的碳青霉烯酶基因或者存在除产碳青霉烯酶以外的耐药机制。

表4 不同年份各耐药基因检出情况Table 4 Prevalence of carbapenemase genes by year

本组资料儿科患者中分离的CRKP耐药程度低于我院CRKP总体耐药水平[10]。虽然菌株对喹诺酮类的耐药率高达60%以上，但菌株对氨基糖苷类药物以及甲氧苄啶-磺胺甲唑的耐药率仅约15.7%～30.5%。由于氨基糖苷类、磺胺类药物毒性较大，通常不建议用于儿科患者，即使在体外药敏试验中显示敏感，在儿科患者抗感染治疗中选择此类药物仍需谨慎。头孢他啶-阿维巴坦是2015年FDA正式批准用于治疗CRE感染的新药，此类药物对于产KPC酶肺炎克雷伯菌感染疗效显著，但不适用于产NDM和OXA酶菌株感染的治疗[11]。本研究显示，儿科患者中，产NDM和OXA酶的菌株亦占据很大比例，故对于儿科患者，除非已明确引起感染的CRKP产KPC酶，否则不应建议经验性应用头孢他啶-阿维巴坦进行抗CRKP感染治疗。虽然NDM、IMP等基因阳性的CRKP通常同时携带超广谱β内酰胺酶（ESBL）基因而表现出对氨曲南高度耐药，但NDM、IMP等金属酶并不能水解氨曲南，因此，对于金属酶阳性的菌株，可考虑碳青霉烯类或头孢他啶-阿维巴坦等能抑制ESBL的抗菌药物联合氨曲南进行治疗[12]。最近，Tanır Basaranoglu等[13]报道，两种碳青霉烯类抗菌药物联合多黏菌素或氨基糖苷类药物也能成功治疗儿童多重耐药肺炎克雷伯菌感染。

加强医院感染预防控制措施是阻断CRKP在儿科患者中流行的关键。本组资料显示儿科患者CRKP目前流行范围广泛，涉及新生儿科、儿内科、儿外科、儿科ICU等各个科室，其中以儿科ICU检出量最多，这可能与ICU相对较为封闭，患者病情较重、抗生素暴露和侵袭性操作率较高，住院时间较长等因素有关。本研究还发现，携带KPC基因和NDM基因的菌株更容易引起多部位感染和长时间定植于宿主体内。为避免CRKP的流行范围进一步扩散，应加强对产KPC酶和NDM酶菌株的监测，对儿科ICU、新生儿ICU等流行严重的病区进行干预，如加强手卫生、接触隔离、对CRKP感染患儿进行标识、必要时对感染患者进行隔离等措施。

综上所述，CRKP在本院儿科患者中的流行情况愈演愈烈，其耐药程度高，所携带的耐药基因种类繁多，应引起足够重视。对于儿科ICU等CRKP存在流行的科室应加强感控措施，以避免耐药菌株进一步流行播散。