基于多重表型分析的准确评价高粱抗旱性方法的建立

张笑笑 潘映红 任富莉 蒲伟军 王道平 李玉斌 陆 平 李桂英,* 朱 莉,*

基于多重表型分析的准确评价高粱抗旱性方法的建立

张笑笑1,2潘映红3任富莉2蒲伟军2王道平3李玉斌2陆 平3李桂英3,*朱 莉2,*

1西南科技大学, 四川绵阳 621000;2中国农业科学院生物技术研究所, 北京 100081;3中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081

干旱是制约农业生产的重要非生物胁迫之一, 因此作物抗旱性研究具有重要理论和应用价值。本研究对73份高粱材料萌发期和苗期的抗旱性进行了初筛, 从中选择15份抗旱材料和6份敏感材料, 通过室内和田间试验, 获得干旱胁迫下幼苗的株高、叶长、叶宽等形态特征以及超氧化物歧化酶、丙二醛、过氧化物酶等生理生化指标的响应数据, 并对高粱的抗旱性做进一步的验证, 最终确定抗旱型材料1份, 中等抗旱型材料1份, 干旱敏感型材料2份。本研究建立了一套基于多重表型分析的高粱抗旱性研究新方法, 即综合运用多种数据分析方法(包括隶属函数法、主成分分析法、聚类分析法), 结合不同生长环境(田间试验和室内试验)和不同生育期(萌发期和苗期)高粱响应干旱胁迫的多种表型数据(形态特征、生理生化指标), 通过多重比较高粱抗旱性评价结果的一致性, 旨在系统、高效、准确地判定高粱的抗旱性, 为高粱抗旱机制的研究和抗旱新品种的选育提供技术支撑。

多重表型分析; 高粱; 抗旱性; 萌发期; 苗期

随着全球气候变暖及水资源供需矛盾的加剧, 干旱已成为影响世界粮食生产最主要的非生物因素。高粱([L.] Moench)是世界上第五大禾谷类作物[1], 也是非洲等地的主要粮食来源。其适应性较广, 可作为高辐射、少降水的贫瘠地区种植的首选作物[2]。高粱具有较强的耐旱性, 但品种间的耐旱性存在很大差异, 因此耐旱品种的选育是提高干旱地区高粱产量的必要措施。

世界现存的高粱种质超过38,000份, 但目前能够成功应用在高粱抗旱育种的数量非常有限, 仅占世界总量的3%[3], 究其原因在于大部分高粱种质资源的抗旱性尚不明确, 缺乏一个高效、经济的耐旱性筛选方法。Reddy等[4]开发了几种较为有效和可靠的筛选技术, 如利用胚芽鞘和中胚轴长度、土壤高温条件下的出苗率, 以及幼苗在短期干旱、中度干旱和极端干旱胁迫下的恢复能力等指标鉴定高粱的抗旱性。此外, 还可以通过选择干旱条件下基因型/突变体的精确表型(形态、生理和产量贡献性状), 制定有效的试验室或田间筛选技术来评定干旱对作物的影响[5]。但是由于田间干旱试验受环境影响较大, 重复性差, 因此仅仅通过田间试验进行作物的抗旱性筛选存在一定的难度和不准确性。

由于作物生长周期较长, 建立和应用萌发期及苗期的快速鉴定方法将有助于提高抗旱性研究效率。萌发期是作物生长的关键时期, 在室内通过模拟干旱胁迫进行萌发期的抗旱筛选, 具有环境稳定、操作性强, 也具有可对大批量的品种进行初步筛选的优点, 因此被广泛应用于小麦[6]、玉米[7]、向日葵[8]、高粱[9]的抗旱性鉴定。然而某些品种在不同生长发育时期的抗性存在差异, 即萌发期抗旱的品种并不一定代表其中后期也抗旱[10]。而苗期干旱会严重影响植株的生长和生存能力[5], 并且苗期的抗旱筛选具有时间短、重复性强和简单易行等优点[11], 因此针对苗期的抗旱性评价也十分必要。

苗期抗旱性多采用干旱胁迫下的生理指标进行评价, Azarinasrabad等[12]认为植物的生理特征可以作为是否受到水分胁迫的良好指标。在干旱胁迫下, 植物产生大量的活性氧(reactive oxygen species, ROS), 并与生物膜大分子反应导致膜脂过氧化, 使丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量升高, 最终破坏生物膜的透过性, 同时引起类囊体膜损伤, 导致叶绿素含量下降, 光合作用降低[13]; 而超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)则通过催化超氧阴离子自由基生成H2O2, 后者再由过氧化物酶(peroxidase,POD)脱毒[14], 从而加速ROS释放与消耗[15], 进而减轻干旱对植物的迫害。根据叶绿素含量、丙二醛含量、SOD及POD活性等生理生化指标在干旱胁迫响应中的变化趋势来评价作物的抗旱性, 已在玉米[16]、水稻[17]、小麦[18]等作物中得到广泛应用, 然而也有研究发现抗旱性强的品种在PEG (polyethylene glycol)模拟干旱胁迫下某些生理指标变化幅度较小, 某些生理指标变化幅度较大, 说明仅凭生理指标变化幅度并不能准确真实反映作物的抗旱性[19]。

干旱胁迫不仅对植物的生理层面产生影响, 而且对植物的形态特征会产生不同程度的影响。已有研究表明, 干旱胁迫会导致萌发期种子的相对发芽势、相对发芽率和萌发抗旱指数等受到影响, 因而这些形态参数常被作为不同品种萌发期抗旱性鉴定的重要指标。严重的干旱会抑制种子的萌发, 而适宜的干旱可能会促进种子的萌发[20]。而幼苗期, 随干旱胁迫时间的延长, 株高、叶面积显著降低, 根冠比显著增大[21]。由此可知, 单从某一时期测定的指标来判定品种的抗旱性存在一定的局限性, 应结合多时期的形态和生理生化指标对作物抗旱性进行综合评价。

当前多元数据统计分析方法已被广泛应用在作物抗旱性研究中。其中Mulima等[22]利用主成分分析法和聚类分析法对26份高粱材料的形态特征进行基因型分组, 为抗旱育种提供抗性亲本材料。埃塞俄比亚东北部Sirinka农业研究中心利用主成分分析和聚类分析对雨养和灌溉2种试验条件下的196份高粱种质的14个形态性状的数据进行分析, 成功表征了这些品种的抗旱性[23]。汪灿等[24]采用隶属函数法、主成分分析法、聚类分析等多项统计分析方法, 通过隶属函数值、抗旱性度量值(值)、综合抗旱系数和权抗旱系数对50份高粱的抗旱表型进行系统评估, 并确定了与值密切相关的产量相关表型可作为高粱成株期抗旱性评价的指标。各个分析方法均有各自的特点, 其中隶属函数法与主成分分析法虽然广泛用于作物抗旱性分析, 但其结果是数值化的抗旱得分, 仅根据得分的微小差异就判定品种间抗旱性存在差异是不合理的, 在抗旱性评价方面仍有不足之处, 而聚类分析可以将抗旱性接近的归为一类, 对抗旱性的鉴定结果起到了很好的分类作用, 因此综合多种方法能够较为准确地评价作物的抗旱性。

本研究以73份高粱种质资源或突变体为初始试验材料, 通过PEG-6000对萌发期和苗期模拟干旱, 初步筛选抗旱和敏感品种, 并将这些高粱品种通过田间干旱试验和室内PEG模拟试验, 获取响应干旱的株高、叶长、叶宽等形态以及MDA、SOD、POD等生理生化数据, 进而采用多种数据分析方法分别进行抗旱性的评价, 最后综合分析不同生长环境和不同方法对高粱抗旱性评价的差异, 建立一套新型的、准确的高粱抗旱性分析方法(图1), 同时筛选出抗旱性突出的材料。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料共73份, 包括33份高粱品种资源和40份甜高粱品种“九甜一”EMS诱变获得的突变系, 编号依次为D01~D73, 分别由中国农业科学院作物科学研究所、生物技术研究所提供(表1)。

图1 多重表型分析方法概要

表1 73份高粱材料信息

(续表1)

1.2 试验方法

1.2.1 室内萌发期和苗期抗旱初筛 采用PEG-6000模拟干旱进行萌发期抗旱性鉴定[9-10], 设0 (CK)和15% PEG-6000两个浓度。选每份高粱材料大小一致、饱满、无病害的种子各40粒(每个处理20粒), 用2% NaClO消毒10 min, 蒸馏水清洗3遍后置对应浓度溶液的培养皿中, 暗处理1 d, 之后进行25℃、12 h/12 h光周期培养, 每2 d更换一次溶液, 设3次重复, 根据相对发芽势、相对发芽率和萌发抗旱指数对高粱进行抗旱性评价。

苗期试验采用水培法。选取大小一致、饱满的高粱种子消毒清洗, 置20 mL蒸馏水的培养皿里培养7 d, 其中暗处理1 d, 光周期培养6 d。之后挑取长势一致的苗分别进行对照和20% PEG胁迫处理(每个处理10株苗), 设3次重复。每2 d更换一次溶液, 于处理7 d时根据萎蔫指数判定高粱的抗旱性。

1.2.2 田间苗期抗旱性验证 于2018年5月9日, 在廊坊基地旱棚播种21份高粱, 设2个区(对照组和干旱处理组), 每个区长8.44 m、宽3.29 m。行距40 cm、株距20 cm, 每行为1个品种(20株), 于五叶期进行干旱处理(不浇水), 对照组正常浇水。干旱处理30 d时测定叶绿素含量、株高、叶长和叶宽, 并取嫩叶, 测定脯氨酸含量。每组处理设3次重复。

1.2.3 室内苗期抗旱性复筛 选取高粱种子100粒, 消毒清洗, 置培养皿, 暗处理1 d, 25℃、光周期(12 h/12 h)培养, 第5天转移至1/4×Hogland营养液[25]里, 并于三叶期进行20% PEG处理, 设3次生物重复, 3次技术重复, 处理24 h时, 测定株高, 并取叶片测定SOD、POD活性和MDA含量。

1.3 检测指标和方法

1.3.1 萌发期测定项目 自种子萌发之日起, 记录种子第2、第4、第6、第8天发芽数, 胚芽长度为种子直径的1/2为发芽标准; 计算第4天的发芽势和第10天的发芽率, 并计算相对发芽势、相对发芽率和种子萌发抗旱指数。

发芽势(GP, %) = 4 d发芽种子数/供试种子数×100; 相对发芽势(%) = (处理发芽势/对照发芽势)×100; 发芽率(GR, %) = 10 d发芽种子数/供试种子数×100, 相对发芽率(%) = (处理发芽率/对照发芽率)×100; 种子萌发抗旱指数(DGRI) = 干旱种子萌发指数/对照种子萌发指数, 萌发指数= 1.00nd2+0.75nd4+ 0.50nd6+ 0.25nd8, 其中, nd2、nd4、nd6、nd8分别为第2、4、6、8天的种子发芽率[9]。

1.3.2 苗期萎蔫指数等级判定 从20%PEG处理后的第7天开始调查幼苗表型变化, 并根据王兰芬等[26]的方法进行判定。

1.3.3 表型与生理生化指标检测 随机选每份材料各3株, 测定株高、叶长、叶宽, 测定叶绿素含量(SPAD)、丙二醛含量、脯氨酸含量以及SOD和POD活性。采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛含量, 采用茚三酮法测定脯氨酸含量, 采用文献[27]的方法测定SOD和POD活性。

1.4 数据处理与分析

1.4.1 隶属函数法的应用 参照文献[9]计算隶属函数值, 当某一指标与抗旱性正相关时, 采用公式(1): ()=(-min)/(max-min); 反之, 采用公式(2): ()=1-(-min)/(max-min); 平均隶属函数值采用公式(3):= (1/)∑。其中为第个材料第个性状的隶属值,为第个材料第个性状处理与对照的比值;max、min分别为该性状中最大和最小比值。

为将室内初筛的苗期结果同萌发期结果进行较好的比较, 对苗期萎蔫指数等级(WI)进行赋值。将五级赋值1.00, 则一级赋值0.20, 二级赋值0.40, 三级赋值0.60, 四级赋值0.80, 等级越高, 对干旱越敏感,故采用1-萎蔫指数等级赋值评价不同高粱的抗旱性。其中萎蔫指数等级一级、二级和三级定为抗旱性较强, 萎蔫指数四级定为抗旱中等, 萎蔫指数五级定为干旱敏感。利用HemI 1.0软件绘制热图。

1.4.2 主成分分析法和聚类分析法的应用 采用SPSS 22.0对获得的表型数据的相对值(相对值=干旱处理均值/对照均值)进行主成分分析和聚类分析。利用GraphPad Prism 5软件绘制条形图。

1.4.3 多重表型分析法的应用 为消除量纲, 采取所测指标数据的相对值进行主成分分析和聚类分析(相对值= 处理值/对照值)。多重表型分析采取公式: 标准值= (-min)/(max-min)将主成分综合得分和平均隶属函数值标准化到区间[0, 1], 并计算两者差异值= |-|, 其中为某材料的主成分综合得分或者平均隶属函数值,max、min分别为综合得分/平均隶属函数值中的最大和最小值,为某材料的平均隶属函数值的标准值,为某材料的综合得分的标准值。采取差异值0.5作为评判不同方法分析结果和同一方法在不同环境的分析结果之间差异的标准。利用GraphPad Prism 5软件绘制柱状图和散点图。

2 结果与分析

2.1 高粱萌发期和苗期抗旱性室内鉴定

在15%PEG模拟干旱胁迫处理下, 高粱材料的萌发受到不同程度的影响。基于隶属函数法对不同高粱材料种子的相对发芽势、相对发芽率和萌发抗旱指数的分析, 并根据平均隶属函数值评价73份高粱材料的抗旱性, 平均隶属函数值越大, 其抗旱性越强。其中D07和D38的平均隶属函数值较大, 相对抗旱; D47及其后的高粱材料平均隶属函数值均小于0.07, 相对干旱敏感(图2)。基于萎蔫指数对苗期不同高粱材料在20%PEG干旱胁迫下的不同生长影响, 初步筛选出抗旱性较强的材料15份, 抗旱中等的材料24份, 干旱敏感的材料24份。

图2 不同高粱材料萌发期的抗旱指标隶属函数值及苗期萎蔫指数等级

RGP: 相对发芽势; RGR: 相对发芽率; DGRI: 萌发抗旱指数; ASFV: 平均隶属函数值; 1-WI: 1-苗期萎蔫指数等级赋值。

RGP: relative germination potential; RGR: relative germination rate; DGRI: germination drought resistance index; ASFV: average subordinative function value; 1-WI: 1-wilting index level assignment at seedling stage.

综合初筛结果, 萌发期和苗期都抗旱的材料有5份, 其编号分别为D04、D14、D19、D22和D37, 排列于萌发期抗旱前17位; 萌发期和苗期都敏感的材料有6份, 其编号分别为D40、D41、D42、D49、D51和D53, 而苗期抗旱性表现较好的材料是D05、D10、D11、D16、D18、D24、D43、D60、D62和D65 (图2)。为进一步明确这21份材料的抗旱性, 进行了旱棚验证。

2.2 不同分析方法对21份高粱材料田间与室内苗期抗旱性的评价

2.2.1 利用隶属函数法分析不同高粱材料苗期抗旱性 田间试验中D11和D16抗旱性较强, D22、D53和D65对干旱比较敏感。室内试验中D11抗旱性最强; D49和D53抗旱性差(表2)。

表2 21份高粱材料基于隶属函数法的苗期抗旱性综合评价

2.2.2 利用主成分法分析不同高粱材料苗期抗旱性

对田间试验21份高粱材料的5项指标(株高、叶长、叶宽、叶绿素含量和脯氨酸含量)进行主成分分析, 根据特征根大于1的原则提取出3个主成分, 累积贡献率为70.325%, 由特征向量得到各主成分的解析式1= 0.5141+ 0.0852+ 0.6133+ 0.27740.2225;2=-0.061+ 0.7572+ 0.2293-0.36140.3335;3=-0.3481+ 0.0142+ 0.2283-0.45540.7435;其中ZX~ZX分别代表株高、叶长、叶宽、叶绿素含量、脯氨酸含量的标准化值。综合得分解析式以各主成分贡献率为权数对主成分得分进行加权平均, 即= 0.0631+ 0.2832+ 0.3703-0.15540.1995, 将各指标标准化值代入表达式即得到各高粱品种的抗旱综合得分, 综合得分越高, 抗旱性越强。其中D05的综合得分最大, 抗旱性较强, D40的综合得分最小, 对干旱敏感(图3-A)。

对室内试验21份高粱材料的4项指标(株高、SOD、MDA、POD)进行主成分分析, 提取特征根大于1的2个主成分, 累积贡献率为77.574%, 综合得分表达式为=-0.0251+ 0.3822-0.0253+ 0.4194, 其中1~4分别代表株高、SOD、MDA、POD的标准化值。将各指标标准化值代入表达式得到各高粱品种的抗旱综合得分, 其中D11的综合得分大于2, 抗旱性较强。D53的综合得分小于-1, 对干旱敏感(图3-B)。

2.2.3 利用聚类分析法分析不同高粱材料苗期抗旱性 采用离差平方和法对田间试验21份高粱材料的5项指标(株高、叶长、叶宽、叶绿素含量和脯氨酸含量)相对值数据进行聚类分析, 可以分为三大类(图4-A)。第I类群包括D05、D11和D43高粱材料, 属于抗旱型; 第II类群包括11份高粱材料D10、D49、D14、D42、D62、D51、D19、D65、D22、D04和D60, 属于中等抗旱型; 第III类群包括7份高粱材料D16、D40、D18、D37、D41、D53和D24, 属于干旱敏感型。

图3 21份高粱材料基于主成分分析法的苗期抗旱性综合评价

A: 21份高粱材料田间抗旱性综合得分; B: 21份高粱材料室内抗旱性综合得分。

A: comprehensive scores of drought resistance of 21 sorghum accessions in field test; B: comprehensive scores of drought resistance of 21 sorghum accessions in laboratory test.

图4 21份高粱材料基于聚类分析法的苗期抗旱性评价

A: 21份高粱材料田间抗旱性聚类分析结果; B: 21份高粱材料室内抗旱性聚类分析结果。

A: clustering analysis results of drought resistance of 21 sorghum accessions in field test; B: clustering analysis results of drought resistance of 21 sorghum accessions in laboratory test.

根据室内试验21份高粱材料各单项指标(株高、SOD、MDA、POD)的相对值数据, 采用离差平方和法对21份高粱材料进行聚类分析, 可以分为三大类(图4-B)。第I类群包括D11号高粱材料, 属于抗旱型; 第II类群包括9份高粱材料D42、D40、D14、D16、D18、D37、D05、D22和D65, 属于中等抗旱型; 第III类群包括11份高粱材料D24、D04、D43、D62、D10、D41、D53、D49、D19、D51和D60, 属于干旱敏感型。

2.3 基于多重表型分析法对高粱抗旱性的综合评价

采用多重表型分析法, 通过不同生长环境(田间试验和室内试验)和不同分析方法(隶属函数法和主成分分析法)结果之间差异值的比较, 以获得抗旱性一致的材料。若差异值大于0.5, 说明不同生长环境或不同分析方法比较的结果差异较大, 抗旱性不一致。

2.3.1 同一生长环境采用不同分析方法对高粱抗旱性评价的差异比较 采用多重表型分析法, 比较同一生长环境下不同分析方法对高粱抗旱性评价的差异。发现在田间试验条件下和室内试验条件下21份高粱材料隶属函数法和主成分分析法比较结果差异值都小于0.5 (图5-A中的a和b), 说明采用隶属函数和主成分分析法分析同一组数据差异较小。

综合聚类分析的相似性原则和距离最近分类原则, 将隶属函数法和主成分分析法的结果按聚类结果分为三类, 类内高粱材料无顺序差异(图4)。田间试验3种方法结果比较得到抗旱型材料D05, 中等抗旱型材料D10和D14, 干旱敏感型材料D53, 共计4份高粱材料; 室内试验3种方法结果比较得到抗旱型材料D11, 中等抗旱型材料D14、D16、D18、D22、D37、D40和D42, 干旱敏感型材料D04、D10、D24、D41、D43、D49、D51、D53和D60。

2.3.2 同一分析方法对不同生长环境生长的高粱抗旱性评价的差异比较 采用同一分析方法对田间和室内试验的高粱抗旱性评价结果进行比较, 发现有少数材料用同一种分析方法时, 差异值>0.5 (图5-A中的c、d和e), 说明不同生长环境下采用同一方法分析有一定的差异, 即高粱的抗旱性随生长环境的不同会表现出差异性。利用主成分分析法分析时, 以差异值0.5作为参考线, 差异较大的有6份材料(D05、D16、D19、D41、D43和D60); 利用隶属函数法分析时, 以差异值1.0作为参考线, 差异较大的有5份材料(D05、D16、D41、D43和D49)(图5-B)。另将田间隶属函数法同室内主成分分析法比较, 以差异值1.2和1.75作为参考线, 发现5份材料(D16、D19、D41、D43和D49)差异较大(图5-B)。

3 讨论

干旱是植物生长发育过程中的一个非常重要的非生物胁迫因子。干旱胁迫下植物的生长变化及响应机理一直是科学研究的热点和难点。植物在长期的进化过程中形成适应性的形态结构[5,28]、生理响应和生化过程[29]来降低干旱胁迫危害, 因此, 开展植物抗旱性研究对培育抗旱新品种、改良植物抗旱调控措施、促进农业的可持续发展具有重要意义。

作物种质资源的抗旱性研究对于育种工作有着非常重要的意义[30]。目前隶属函数、主成分分析和聚类分析方法已经在大豆[31]、小麦[32]、玉米[33]、花生[34]等作物抗旱性评价中广泛应用, 并且已有研究报道, 采用此3种方法对高粱萌发期进行PEG胁迫已筛选到具有抗旱能力的高粱品种[9-10], 说明采用此3种方法对高粱抗旱性评价是可行的, 同时发现不同分析方法的结果存在一定的差异, 所以本研究在采用多种分析方法(隶属函数法、主成分分析和聚类分析)基础上, 建立了一种新型抗旱性评价方法。相对单一方法, 多重表型分析法综合了各个方法的优点, 同时也避免了单一方法的弊端, 消除了单一指标的片面性和多个指标的信息重叠, 结果更合理可靠。

图5 不同高粱抗旱性多重表型分析结果的差异度比较

A:不同分析方法和不同生长环境的多重表型分析结果的差异度比较; B:不同生长环境下高粱抗旱性多重表型分析结果的差异度比较。a: 田间试验条件下隶属函数法与主成分分析法分析结果之间的比较; b: 室内试验条件下隶属函数法与主成分分析法结果之间比较; c: 田间与室内试验主成分分析法结果比较; d: 田间与室内试验隶属函数法结果比较; e: 田间试验隶属函数法与室内试验主成分分析法结果之间比较。其中实线(0.5和1.0)作为c和d差异值的参考线, 用以评估不同生长环境同一分析方法多重表型分析结果的差异度; 虚线(1.20和1.75)和实线(1.5)作为e差异值的参考线, 用以评估田间试验隶属函数与室内试验主成分分析结果的差异度。

A: comparison of differences in multilevel phenotypic analysis results between by different methods and in different growth environments; B:comparison of differences in multilevel phenotypic analysis results of sorghum drought resistance under different growth environments. a: comparison between the results of the subordinate function method and the principal component analysis method under field test conditions; b: comparison between the results of the subordinate function method and the principal component analysis method under laboratory test conditions; c: comparison between the results of the principal component analysis in field and laboratory test; d: comparison the results of subordinate function methods between in field and in laboratory test; e: comparison the results between subordinate function method in field test and principal component analysis in laboratory test . The solid lines (0.5 and 1.0) were used as the reference lines for the difference values of c and d to evaluate the differences in the results of multilevel phenotypic analysis with the same analysis method in different growth environments; the dotted lines (1.20 and 1.75) and the solid line (1.5) are used as reference for the e difference value, which is used to assess the difference between the results of subordinate function in field test and the results of the principal component analysis in laboratory test.

经过多重表型分析发现采用多种方法对高粱苗期抗旱性综合评价具有一定的可靠性与差异性。该方法在综合运用3种分析方法的基础上, 进一步说明采用不同分析方法准确评定同一生长环境下不同高粱材料抗旱性的可行性, 同时, 也发现了采用同一分析方法评价不同生长环境下高粱抗旱性存在差异性的问题。同一生长环境不同方法分析结果差异值均小于0.5, 证明了不同方法分析同一条件下的数据是可行的。另外通过同一分析方法(隶属函数法)对不同生长环境生长的高粱抗旱性评价的差异比较,发现田间试验和室内试验的抗旱性结果有一定的差异, 但总体上仅有极少数品种的田间实验和室内实验结果差异较大, 并且发现差异较大的品种在多重表型分析后已被淘汰, 说明多重表型分析法可以对抗旱性做出较好的评估。同时发现图5-A的e和d中各散点分布比较相似, 侧面反映室内不同方法比较结果相似, 具有较高的可信度。

综合分析田间试验3种方法后, 从21份高粱材料中确定4份抗旱性一致的材料, 而3种方法都是针对同一数据进行的分析, 推测可能是由于主成分分析丢失信息所致, 因为主成分分析是从所有数据中提取了部分信息, 舍弃该方法结果, 将隶属函数和聚类分析结果比较后得到抗旱型材料1份(D11), 中等抗旱型材料3份(D18、D37、D40), 干旱敏感型材料6份(D04、D10、D49、D51、D60、D65)共计10份高粱材料。将此结果和室内3种方法分析结果比较, 最终得到抗旱型材料D11, 中等抗旱型材料D14, 干旱敏感型材料D53和D24。其中D11 (糯高粱)和D14 (千斤锤)对应在室内初筛时其苗期萎蔫指数等级属三级, D53 (SEM-42-1)属于五级, 结果吻合; 而D24 (河北糯杂5号)在室内初筛苗期萎蔫指数属于二级, 比较抗旱, 与多重表型分析的结果有差异, 可能是由于苗期萎蔫指数属直观观察的数据, 有一定的误差, 但可以综合几项指标共同判定抗旱性。

作物的抗旱性是由多个主效基因和微效基因控制的数量性状, 受基因型和环境因素的共同影响[35], 有些作物整个生育期的抗旱性一致, 而有些作物整个生育期的抗旱性不一致[10]。本研究发现, 部分材料萌发期抗性和苗期抗旱性存在差异。在此基础上选择萌发期和苗期抗性一致的材料及萌发期和苗期的抗性材料和敏感材料又分别进行了田间和室内的苗期干旱复筛, 通过形态特征和生理指标相结合, 综合运用多种数据分析方法对各品种的抗旱性评价表明, 不同高粱材料在不同生长条件下、不同生育期其抗旱性有所不同, 因此通过建立多重表型分析方法获得抗旱性明确、鉴定结果一致的材料是非常有必要的。本研究仅针对高粱萌发期和苗期的抗旱性评价, 而对于高粱全生育期的抗旱性评价, 依然需要通过田间对产量相关性状的评估来进一步做出科学、准确的判定。另外, 由于基因遗传指令转化为性状的方式仍不清楚, 所以表型数据将继续成为重要生物学结果的有力预测指标[36], 而随着表型组学技术的发展, 高通量的表型分析技术将广泛应用在作物响应干旱胁迫的研究, 从而更快速、高效、准确地鉴定作物的抗旱性。

4 结论

通过73份高粱材料室内PEG干旱胁迫下萌发期相对发芽势、相对发芽率和苗期萎蔫指数等相关表型鉴定及数据分析, 筛选出15份抗旱型材料和6份敏感型材料, 通过田间和室内苗期的干旱胁迫获取多种表型响应数据(株高、叶长、叶宽等形态特征和MDA、SOD、POD等生理指标), 并采用隶属函数法、主成分分析法和聚类分析法综合评估, 初步建立了一套较为系统、准确评价高粱材料抗旱性的新方法, 同时鉴定到抗旱性突出的高粱材料, 为今后高粱抗旱品种选育、抗旱机理研究提供了技术支撑。

[1] Spindel J E, Dahlberg J, Colgan M, Holingsworth J, Sievert J, Staggenborg S, Hutmacher R, Jansson C, Vogel J P. Association mapping by aerial drone reveals 213 genetic associations for Sorghum bicolor biomass traits under drought., 2018, 19: 679. doi: 10.1186/s12864-018-5055-5.

[2] Solomon A D, Hussein S, Mark L, Fentahum M. The impact of drought on sorghum production, and farmer’s varietal and trait preferences, in the north eastern Ethiopia: implications for breeding.,, 2018, 68: 424–436.

[3] Sakhi S, Shehzad, Rehman S, Okuno K. Mapping QTL’s underlying drought stress at developmental stages of sorghum () by association analysis., 2013, 193: 433–450.

[4] Reddy B V S, Ramaiah B, Kumar A A, Reddy P S. Evaluation of sorghum genotypes for stay-green trait and grain yield., 2007, 3: 1–4.

[5] Badigannavar A, Teme N, Oliveira A C D, Li G Y, Vaksmann M, Viana V E, Ganapathi T R, Sarsu F. Physiological, genetic and molecular basis of drought resiliencein sorghum [(L.) Moench]., 2018, 23: 670–688.

[6] 张树林, 刘玉玲, 田丽, 宋卓恒, 郭瑞林, 彭仁海. 不同小麦新品系萌发期抗旱性的筛选与鉴定. 分子植物育种, 2018, 16: 7138–7147. Zhang S L, Liu Y L, Tian L, Song Z H, Guo R L, Peng R H. Screening and identification of drought resistance of different new wheat lines during germination period., 2018, 16: 7138–7147 (in Chinese with English abstract).

[7] 郭效龙, 宋希云, 裴玉贺, 郭新梅. 玉米自交系萌发期和苗期抗旱性指标的筛选. 植物生理学报, 2018, 54: 1719–1726. Guo X L, Song X Y, Pei Y H, Guo X M. Screening of drought resistance indexes of maize inbred lines., 2018, 54: 1719–1726 (in Chinese with English abstract).

[8] 温蕊, 侯建华, 张艳芳, 吕品, 马宇. 干旱胁迫对向日葵种子萌发的影响及其抗旱性鉴定. 干旱农业地区研究, 2018, 36(2): 192–197. Wen R, Hou J H, Zhang Y H, Lyu P, Ma Y. Effect of drought stress on seed germination of sunflower on and identification of drought resistance of main variety., 2018, 36(2): 192–197 (in Chinese with English abstract).

[9] 陈冰嬬, 徐宁, 李淑杰, 李继洪, 侯佳明, 李伟, 石贵山, 檀辉, 高士杰, 王鼐. 高粱亲本系萌发期抗旱性鉴定. 中国农业大学学报, 2018, 23(8): 17–29. Chen B X, Xu N, Li S J, Li J H, Hou J M, Li W, Shi G S, Tan H, Gao S J, Wang N. Identification of the drought resistance of sorghum parental lines at germination stage., 2018, 23(8): 17–29 (in Chinese with English abstract).

[10] 吴奇, 周宇飞, 高悦, 张姣, 陈冰嬬, 许文娟, 黄瑞冬. 不同高粱品种萌发期抗旱性筛选与鉴定. 作物学报, 2016, 42: 1233–1246. Wu Q, Zhou Y F, Gao Y, Zhang J, Chen B X, Xu W J, Huang R D. Screening and identification for drought resistance during germination in sorghum cultivars., 2016, 42: 1233–1246 (in Chinese with English abstract).

[11] 刘方明, 高玉山, 孙云云, 窦金刚, 刘慧涛, 王立春. 高粱抗旱性鉴定研究进展.东北农业科学, 2016, 41(3): 5–7. Liu F M, Gao Y S, Sun Y Y, Dou J G, Liu H T, Wang L C. Advances of researches on identification of drought resistance of sorghum., 2016, 41(3): 5–7 (in Chinese with English abstract).

[12] Azarinasrabad A, Mousavinik S M, Galavi M, Begeshti S A, Sirousmehr A. Evaluation of water stress on yield, its components and some physiological traits at different growth stages in grain sorghum genotypes., 2016, 8: 204–210.

[13] Tambussia E A, Bartolia C G, Beltranoa J, Guiameta J J, Araus J L. Oxidative damage to thylakoid proteins in water-stressed leaves of wheat ()., 2000, 108: 398–404.

[14] Apel K, Hirt H. Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal transduction., 2004, 55: 373–399.

[15] Choudhury S, Panda P, Sahoo L, Panda S K. Reactive oxygen species signaling in plants under abiotic stress., 2013, 8: 1559–2324.

[16] 孙欢欢, 韩兆雪, 谭登峰, 张小燕. 新培育玉米自交系苗期生理生化指标与其抗旱性综合评价. 干旱农业地区研究, 2016, 34(5): 9–14. Sun H H, Han Z X, Tan D F, Zhang X Y. Comprehensive evaluation of physiological and biochemical indexes and drought resistance of new maize inbred lines during seedling stage., 2016, 34(5): 9–14 (in Chinese with English abstract).

[17] Lee D, Chung P J, Jeong J S, Jang G, Bang S W, Jung H, Kim Y S, Ha S, Choi Y D, Kim J. The rice OsNAC6 transcription factor orchestrates multiple molecular mechanisms involving root structural adaptions and nicotianamine biosynthesis for drought tolerance., 2016, 15: 754–764.

[18] 毛浩田, 陈梦莹, 吴楠, 刘海悦, 刘玉林, 张怀渝, 陈洋尔. 干旱胁迫对不同倍性小麦和八倍体小黑麦苗期光合能力与抗氧化系统的影响. 麦类作物学报, 2018, 38: 1246–1254. Mao H T, Chen M Y, Wu N, Liu H Y, Liu Y L, Zhang H Y, Chen Y E. Effects of drought stress on photosynthetic capacity and antioxidant system in wheat with different ploidy levels and octoploid triticale at seedling stage., 2018, 38: 1246–1254 (in Chinese with English abstract).

[19] 骆建霞, 黄榆婷, 曾丽蓉, 李钊, 赵嘉菱, 郭冰鑫. PEG模拟干旱胁迫对4种海棠幼苗生理特性的影响. 天津农学院学报, 2016, 23(3): 1–5. Luo J X, Huang Y T, Zeng L Y, Li Z, Zhao J L, Guo B X. Effects of PEG simulated drought stress on physiological characters of four crabapple seedlings., 2016, 23(3): 1–5 (in Chinese with English abstract).

[20] 王艺陶, 周宇飞, 李丰先, 依兵, 白薇, 闫彤, 许文娟, 高明超, 黄瑞冬. 基于主成分和SOM聚类分析的高粱品种萌发期抗旱性鉴定与分类.作物学报, 2014, 40: 110–121. Wang Y T, Zhou Y F, Li F X, Yi B, Bai W, Yan T, Xu W J, Gao M C, Huang R D. Identification and classification of sorghum cultivars for drought resistance during germination stage based on principal components analysis and self organizing map cluster analysis., 2014, 40: 110–121 (in Chinese with English abstract).

[21] 孙海博, 任瑞芬, 郭芳, 尹大芳, 杨秀云. 干旱胁迫下美国薄荷幼苗形态与生理特性研究. 山西农业大学学报(自然科学版), 2018, 38(4): 65–73. Sun H B, Ren R F, Guo F, Yin D F, Yang X Y. Research on morphological and physiological responses ofseedlings to drought stress.(Nat Sci Edn), 2018, 38(4): 65–73 (in Chinese with English abstract).

[22] Mulima E, Sibiya J, Musvosvi C, Nhamucho E. Identification of important morphological traits in Mozambican sorghum [(L.) Moench] germplasm using multivariate analysis., 2018, 13: 1796–1810.

[23] Derese S A, Shimelis H, Mwadzingeni L, Laing M. Agro- morphological characterisation and selection of sorghum landraces., 2018, 68: 585–595.

[24] 汪灿, 周棱波, 张国兵, 徐燕, 张立异, 高旭, 高杰, 姜讷, 邵明波. 酒用糯高粱资源成株期抗旱性鉴定及抗旱指标筛选.中国农业科学, 2017, 50: 1388–1402. Wang C, Zhou L B, Zhang G B, Xu Y, Zhang L Y, Gao X, Jiang N, Shao M B. Drought resistance identification and drought resistance indices screening of liquor-making waxy sorghum resources at adult plant stage., 2017, 50: 1388–1402 (in Chinese with English abstract).

[25] Tufail A, Arfan M, Gurmani A R, Khan A, Bano A. Salcylic acid induced salinity tolerance in maize ()., 2013, 45: 75–82.

[26] 王兰芬, 武晶, 景蕊莲, 程须珍, 王述民. 绿豆种质资源苗期抗旱性鉴定. 作物学报, 2015, 41: 145–153. Wang L F, Wu J, Jing R L, Cheng X Z, Wang S M. Drought resistance identification of mungbean germplasm resources at seedlings stage., 2015, 41: 145–153 (in Chinese with English abstract).

[27] 路文静, 李奕松. 植物生理学实验教程(第2版). 北京: 中国林业出版社, 2017. pp 132–135. Lu W J, Li Y S. Plant Physiology Experiment Course (2nd edn). Beijing: China Forestry Publishing House, 2017. pp 132–135 (in Chinese).

[28] 王顺才, 邹养军, 马锋旺. 干旱胁迫对３种苹果属植物叶片解剖结构、微形态特征及叶绿体超微结构的影响. 干旱地区农业研究, 2014, 32(3): 15–23. Wang S C, Zou Y J, Ma F W. Influence of drought stress on leaf anatomical structure and micro-morphiology traits and chloroplast ultrastructure of threespecies., 2014, 32(3): 15–23 (in Chinese with English abstract).

[29] Chu G, Chen T T, Wang Z Q, Yang J C, Zhan J H. Morphological and physiological traits of roots and their relationships with water productivity in water-saving and drought-resistant rice.2014, 162: 108–119.

[30] 张嘉楠, 昌小平, 郝晨阳, 刘桂茹, 景蕊莲. 北方冬麦区小麦抗旱种质资源遗传多样性分析. 植物遗传资源学报, 2010, 11: 253–259. Zhang J N, Chang X P, Hao C Y, Liu G R, Jing R L. Genetic diversity of common wheat germplasm resources with drought resistance in Northern China., 2010, 11: 253–259 (in Chinese with English abstract).

[31] Govindasamy V, George P, Aher L, Ramesh S V, Thangasamy A, Anandan S, Raina S K, Kumar M, Rane J, Annapurna J, Annapura K, Minhas P. Comparative conventional and phenomics approaches to assess symbiotic effectiveness of Bradyrhizobia strains in soybean (L. Merrill) to drought., 2017, 7: 6958. doi: 10.1038/s41598-017-06441-3.

[32] Cheng Z, Dong K, Ge P, Bian Y, Dong L, Deng X, Li X H, Yan Y M. Identification of leaf proteins differentially accumulated between wheat cultivars distinct in their levels of drought tolerance., 2015, 10: e0125302.

[33] Wen W, Araus J L, Shah T, Cairns J, Mahuku G, Marianne B, Torres J L, Ciro S, Yan J. Molecular characterization of a diverse maize inbred line collection and its potential utilization for stress tolerance improvement., 2011, 51: 2569–2581.

[34] Upadhyaya H D. Variability for drought resistance related traits in the mini core collection of peanut., 2005, 45: 1432–1440.

[35] 杨彬, 张一中, 周福平, 张海燕, 史红梅, 张桂香, 柳青山, 张晓娟, 范昕琦. 高粱抗旱性鉴定方法及QTL定位研究进展. 植物遗传资源学报, 2019, 20: 496–507. Yang B, Zhang Y Z, Zhou F P, Zhang H Y, Shi H M, Zhang G X, Liu Q S, Zhang X J, Fan X Q. Advances in experimental assays for drought tolerance and QTL mapping of drought resistance in sorghum., 2019, 20: 496–507 (in Chinese with English abstract).

[36] Houle D, Govindaraju D R, Omholt S. Phenomics: the next challenge., 2010, 11: 855–866.

Establishment of an accurate evaluation method for drought resistance based on multilevel phenotype analysis in sorghum

ZHANG Xiao-Xiao1,2, PAN Ying-Hong3, REN Fu-Li2, PU Wei-Jun2, WANG Dao-Ping3, LI Yu-Bin2, LU Ping3, LI Gui-Ying3,*, and ZHU Li2,*

1Southwest University of Science and Technology, Mianyang 621000, Sichuan, China;2Institute of Biotechnology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;3Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

Drought is one of the important abiotic stresses that restrict agricultural production. Research on drought resistance of crops is of significance in both theoretical and practical aspects. In this study, 73 sorghum accessions were preliminarily evaluated for drought resistance at the germination and seedling stages under simulated drought environment with PEG-6000. Among them, 21 accessions including 15 tolerant and 6 susceptible, were screened to measure the morphological characteristics such as plant height, leaf length and leaf width, and physiological and biochemical indicators such as superoxide dismutase (SOD) activity, malondialdehyde (MDA) content, and peroxidase (POD) activity. Finally, one accession was identified with high drought resistance, one accession was moderate drought resistance and two accessions with drought-sensitivity. A new evaluation method for sorghum drought resistance was established based on the multilevel phenotypic analysis, in which the data from subordinate function method, principal component analysis and clustering analysis were comprehensively applied, and combined with various phenotypic data (morphological, physiological and biochemical indicators) at different growth stages (germination and seedling stages) in different growth environments (field test and laboratory test). This method can be used to systematically, efficiently and accurately identify the drought resistance of sorghum based on the consistency of evaluation results by multiple comparison analysis, which is useful in the research on drought resistance mechanism and sorghum breeding for drought resistance.

multilevel phenotypic analysis; sorghum; drought resistance; germination stage; seedling stage

本研究由中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(Y2017PT25), 国家自然科学基金项目(31471558), 国家重点研发项目(2018YFD1000702)和国际原子能机构协调研究项目(D23031)资助。

This study was supported by the Fundamental Research Funds for Central Non-profit Scientific Institution (Y2017PT25), the National Natural Science Foundation of China (31471558), the National Key R&D Program of China (2018YFD1000702), and the IAEA Coordinated Research Project (D23031).

李桂英, E-mail:liguiying@caas.cn; 朱莉, E-mail:zhuli01@caas.cn

E-mail: 1826437817@qq.com

2019-02-14;

2019-05-12;

2019-06-04.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190604.0842.002.html

10.3724/SP.J.1006.2019.94022