细菌瓶法用于反硝化菌菌量的测定*

易绍金，邢燕青，余 灿

（长江大学化学与环境工程学院，湖北荆州434023）

反硝化菌（denitrifying bacteria，简称DNB）是一群能在厌氧条件下将硝酸盐还原成亚硝酸盐进而还原成氮气的一类细菌的总称［1-4］。DNB 是重要的微生物采油功能菌［5］，也是抑制硫酸盐还原菌的重要菌群［6-9］，还是污水生物脱氮的主要菌群［10-11］。因此，在微生物采油、反硝化菌抑制硫酸盐还原菌科学研究、菌剂产品质量检验和油田现场监控及污水生物脱氮处理等工作过程中，常常需要测定DNB的数量（浓度）。

目前，测定DNB菌量的主要方法是最大概率数法（MPN 法）。但是，这种方法存在比较明显的缺陷。首先，该法操作包括清洁玻璃器皿、培养基的配制与灭菌、分装等一系列过程极为繁琐、费时；其次，该法在测定DNB 时要求在厌氧条件下操作，而实际过程中易混入氧气，对操作条件要求较严。因此，工作效率极低的DNB菌量测定方法已经远远不能满足现代高效工作的需要，研制更加简单准确的DNB菌量测定的新方法和新工具迫在眉睫。

孙炳德［12］将细菌测试瓶法用于硫酸盐还原菌（SRB）菌量的测定，认为细菌瓶测试法在菌量测定中既简单准确，又方便快捷。易绍金等［13-15］将细菌瓶测试法用于石油烃降解菌、产表面活性剂菌、黄原胶降解菌等相关细菌菌量测定中，进一步发展并完善了细菌瓶测试法在相关细菌菌量测定中的应用。细菌瓶内装有SRB等细菌的专用培养基，只能用于测定SRB等细菌，而不能用于测定DNB。为了更简便准确的测定DNB的菌量，根据细菌瓶法的基本原理，研制了用于培养DNB的专用测试瓶。在进行了样品的多次实际测试和不断改良后，现已形成成熟的反硝化菌测试瓶（DNB-JH型）产品。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

油田产出液，江汉油田；生物抑制菌液、微生物清防蜡菌剂，湖北三雄科技发展有限公司。STARTER 3100 pH 计，奥豪斯仪器设备有限公司；SPX-300BS-Ⅱ生化培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；AX2202ZH/E电子天平，奥豪斯仪器（常州）有限公司；YM型不锈钢立式电热蒸汽消毒器，上海三申医疗器械有限公司；1.0 mL一次性无菌注射器等。

1.2 DNB测试瓶的制备

（1）DNB培养液的配制

比较不同配方培养液培养DNB 的速度优选培养液配方。反复筛选得到了以有机酸盐为碳源，含有硝酸盐、磷源和化学脱氧剂等组分的专门用于培养DNB的培养液配方及其合适的pH值。该配方按照DNB的生理生化特征所设计，培养出的细菌只是在厌氧条件下将硝酸盐还原成亚硝酸盐进而还原成氮气的DNB，测试工作不受其他细菌的干扰。

（2）生长指示

为了及时准确地反映培养液中有无DNB 的生长，必须确定易于观察的生长指示。要求生长指示特异性强，易于判断。根据DNB代谢特点和代谢产物确定其生长指示。DNB 的生命活动会使培养液产生浑浊，新陈代谢会产生N2，即培养液变浑变浊并出现肉眼可见的气泡为DNB的生长指示。

（3）测试瓶制备与灭菌

将配制好的培养液厌氧分装入标准玻璃瓶（15 mL）中，每瓶装9.0 mL 培养液，然后用橡胶盖和铝盖封口，再按常规灭菌，即为DNB测试瓶。

1.3 测试方法

具体测定方法按细菌瓶常规测定方法进行［13-15］。把接种后的测试瓶放在30℃培养箱内培养，无菌生长的测试瓶内培养液无明显变化，而有菌生长的测试瓶内培养液逐渐变浑变浊并出现肉眼可见的气泡（N2），一般此过程为3数 5 d，因此确定5 d 读数（即样品注入测试瓶后培养5 d后的读数）。

1.4 计数

DNB的测定一般采用二次平行管测定方法［16-17］，可根据表1进行计数。实际样品测定时需乘以稀释倍数。

2 结果与讨论

为了验证细菌瓶法测定的准确性和可靠性，采用工业化生产的DNB-JH型测试瓶对多个油田产出液、生物抑制菌液、微生物清防蜡菌剂等样品中的DNB 数量进行了测定，并与MPN 法测定结果进行对比，选择具有代表性的3 个测定结果分别列于表2、表3和表4。

表1 二次平行管的细菌最大可能值

表2 某油田采出液中DNB测定结果（二次平行）

表3 某生物抑菌剂中DNB测定结果（二次平行）

表4 某微生物清防蜡剂中DNB测定结果（二次平行）

由表2数4 可见，细菌瓶法的测定结果与MPN法基本相同，表明其测试结果准确可靠。而在表3中，可能是由于氧气的混入导致MPN 法所测得的DNB 菌数较细菌瓶法的低，因此，细菌瓶法的测定结果更为准确。常见的平板菌落计数法不适用于厌氧细菌菌量的测定。在测定厌氧细菌的菌量时，MPN法在实际操作过程中容易混入氧气，导致测定结果不准确。而DNB 细菌瓶法由于在培养液中加入了化学脱氧剂并采取了隔氧保护措施，因此在用于DNB菌量的测定过程中，所培养出的细菌只是在厌氧条件下将硝酸盐还原成亚硝酸盐进而还原成N2的DNB，测试工作中不会受氧气和其他细菌的干扰。在判断测试瓶内有无DNB 生长时，有DNB 存在的测试瓶内的培养液逐渐变浑变浊并出现肉眼可见的气泡（N2），生长指示易于观察，测定结果更为准确可靠。

3 结论

细菌瓶法可准确测定样品中的反硝化菌的菌量，可用于微生物采油研究、采油菌液产品质量检验（菌量测定）和微生物采油现场监控等。与传统的MPN 法相比，细菌瓶法具有生长指示明显、操作简便和工作效率高等优点，应用前景良好。