气相色谱-三重四极杆质谱法同时测定巴氏杀菌乳中9种香精成分

刘 通, 王玉娇, 王秀娟, 崔东伟,3, 张 峰*

(1. 中国检验检疫科学研究院食品安全研究所, 北京 100176; 2. 天津科技大学生物工程学院, 天津 300000; 3. 中国医科大学药学院, 沈阳 110122)

巴氏杀菌乳是仅以生牛(羊)乳为原料,经巴氏杀菌等工序制得的液体产品[1]。近年来乳品工业迅猛发展,市场上销售的巴氏杀菌乳品种、规格颇多。部分乳品企业为提高产品的“香”、“浓”,会使用香精等添加剂来增强口味。我国现行的食品安全国家标准GB 2760-2014《食品添加剂使用标准》对巴氏杀菌乳做了明确规定,不得添加任何香精香料,但目前尚缺乏相应的检测方法标准,导致监管缺项。

香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素作为食品添加剂,广泛用于巧克力、冰淇淋、糕点、糖果和乳制品等食物中,但人体超量摄入会对身体健康造成危害,如产生头晕、恶心、呼吸困难,甚至导致肝、肾损伤[2]。香豆素是具有新鲜香草气味的内酯类化合物,在芸香科和伞形科植物中广泛存在。毒理实验表明,香豆素能够对肝肾产生中等毒性,从而危害健康,中国、美国、英国和印度等国家禁止香豆素作为食品添加剂添加到食品中。然而香豆素衍生物如7-甲基香豆素、7-甲氧基香豆素、二氢香豆素、7-乙氧基-4-甲基香豆素和环香豆素等可能被用作香豆素替代物添加到食品中,进而逃避安全监管[3-5]。考虑到香兰素和香豆素类物质的副作用[6],建立其在食品中的同时检测方法十分必要。

目前,针对食品中香兰素和香豆素类致香成分的测定方法主要有气相色谱法(GC)[7]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[8-10]、液相色谱法(LC)[11]、液相色谱-质谱法(LC-MS)[12-14]和毛细管电泳法(CE)[15]等。相比液相色谱法,气相色谱法对应的前处理简单,更易操作,但在复杂基质多组分分析时,气相色谱法存在灵敏度低和检出限高的缺点。GC-MS采用选择离子监测(SIM)模式对化合物进行确认,但受样品基质干扰影响,易出现假阳性结果。气相色谱-三重四极杆技术(GC-MS/MS)是在GC-MS的基础上增加了二级质谱信息,因此选择性和抗干扰能力更强,定量更准确。

郑小严[16]建立了凝胶渗透色谱-气相色谱-三重四极杆质谱测定配方奶粉中香兰素和乙基香兰素的检测方法;李长于等[17]建立了气相色谱-串联质谱测定香精香料中香豆素和黄樟素的检测方法,但目前尚未有香兰素和香豆素以及它们衍生物同时检测的方法报道。本文采用GC-MS/MS技术建立了巴氏杀菌乳中香兰素和香豆素以及它们衍生物的同时检测方法。该方法前处理操作简单,灵敏度高,定性定量准确,可为巴氏杀菌乳中香兰素和香豆素类香精的精准测定提供技术支持。

1 实验方法

1.1 仪器、试剂与材料

7890A/7000C气相色谱-三重四极杆质谱仪(配备自动进样器和电子轰击电离源,美国Agilent公司),数据采集由MassHunter完成;VORTEX KB-3涡旋振荡器(江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司); 3-30K高速冷冻离心机(德国Sigma公司)。

9种香精标准品:二氢香豆素、香兰素、香豆素、乙基香豆素、甲基香豆素、7-甲基香豆素、7-甲氧基香豆素、7-乙氧基-4甲基香豆素和环香豆素(纯度>96%,日本TCI公司)。乙醇、甲醇、乙腈和丙酮(美国Fisher Scientific公司);乙二胺-N-丙基甲硅烷(PSA)(德国Sigma公司);十八烷基键合硅胶(C18)(美国Agilent公司);硫酸镁、无水硫酸钠(成都市科龙化工试剂厂)。

1.2 标准溶液的配制

准确称取9种香精标准品(10.0±0.1) mg,分别置于10 mL容量瓶中,加入少许无水乙醇混匀,待标准品溶解,再加入乙醇定容至10 mL,可得1 mg/mL的标准储备液,于-20 ℃冰箱中储存待用。

分别精密移取各标准储备液100 μL,置于10 mL容量瓶中,用乙醇稀释并定容至10 mL,可得10 μg/mL混合标准溶液,于4 ℃冰箱中储存待用。

1.3 样品前处理

准确称取液体巴氏杀菌乳1 g,置于50 mL离心瓶中,加入15 mL无水乙醇,涡旋1 min,低温离心(4 ℃, 8 000 r/min)5 min,取1 mL上清液,用0.22 μm尼龙滤膜过滤后,上机检测。

1.4 基质标准溶液的配制

分别称取不含目标物的空白巴氏杀菌乳样品1 g(精确至0.01 g),按1.3节方法进行预处理得到基质提取液。用基质提取液作为稀释溶剂制备基质标准溶液。

1.5 GC-MS条件

色谱柱:DB-5MS柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm,美国Agilent公司);进样口温度:250 ℃;进样方式:不分流进样;载气:氦气(≥99.999%);流量:1.0 mL/min。程序升温:初始温度80 ℃,保持2 min,以10 ℃/min的速率升温至170 ℃,保持1 min,以60 ℃/min的速率升温至270 ℃,保持10 min。进样量:1.0 μL。

色谱-质谱接口温度:280 ℃;电子轰击电离(EI)源;电子能量:70 eV;多反应监测(MRM)模式;溶剂延迟:4 min。9种香精化合物的名称、保留时间和质谱参数见表1。

表 1 9种香精成分的保留时间和质谱参数Table 1 Retention time and MS parameters of the nine flavor compounds

* Quantitative ion.

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的考察

升温程序是实现化合物分离非常重要的气相色谱参数,本实验考察了在升温的第一阶段不同升温速率(5、10和20 ℃/min)对化合物分离效果的影响。当第一阶段升温速度为20 ℃/min时,二氢香豆素和香兰素保留时间相近,两个化合物难以分开;采用10 ℃/min和5 ℃/min两种升温速率可实现2种化合物的良好分离,考虑到节约时间,升温速率最终选择10 ℃/min。

2.2 质谱条件的考察

三重四极杆质谱条件的优化参数一般包括母离子、子离子以及碰撞能量等。在MRM参数优化过程中,先通过全扫描模式选取质荷比较大且相对丰度较高的特征碎片作为母离子,然后将母离子进一步裂解,选取2～3个离子作为子离子,最后对每一对母离子/子离子以响应信号大小为依据优化碰撞能量。图1显示了9种香精成分的结构图,在MRM模式下9种香精成分的色谱图见图2。

图 1 9种香精成分的结构图Fig. 1 Structure diagrams of the nine flavor compounds

图 2 9种香精成分的MRM色谱图Fig. 2 MRM chromatograms of the nine flavor compounds 1. hydrocoumarin; 2. vanillin; 3. coumarin; 4. ethyl vanillin; 5. methyl vanillin; 6. 7-methylcoumarin; 7. 7-methoxycoumarin; 8. 7-ethoxy-4-methylcoumarin; 9. pyranocoumarin.

2.3 前处理方法的优化

2.3.1样品前处理的选择

在复杂基质香精成分分析实验中,应尽量减少前处理步骤,开发出方便快速的前处理方法。本研究考察了直接提取-低温离心法和QuEChERS法两种前处理条件下巴氏杀菌乳的提取净化效果。在QuEChERS前处理方法中考察了分别加入10 mg C18、10 mg PSA和5 mg PSA+5 mg C18时9种香精成分的回收率。结果如表2所示,当加入QuEChERS净化材料后,7-甲氧基香豆素回收率低于50%,香兰素、香豆素、乙基香兰素、甲基香兰素、7-甲基香豆素的回收率均低于80%。而采用直接提取-低温离心的前处理方式,9种目标化合物的回收率均在90%～115%之间,满足定性定量检测的要求。因此最终选择操作简单、成本低廉的直接提取-低温离心的前处理净化方式。

表 2 2种前处理方式下9种香精成分的回收率(n=3)Table 2 Recoveries of the nine flavor components usingthe two pretreatment methods (n=3) %

C18: octadecyl bonded silica; PSA: ethylenediamine-N-propylsilane.

2.3.2提取溶剂的选择

提取溶剂的选择在前处理步骤中非常重要,合适的提取溶剂能有效提高提取效率。根据香豆素和香兰素类衍生物易溶于极性溶剂的性质,考察了甲醇、乙醇、乙腈和丙酮4种溶剂的提取效果。结果如图3所示,当使用丙酮时,其中3种香精成分的回收率在70%以下;当使用甲醇时,二氢香豆素的回收率仅为40.1%;使用乙腈时,二氢香豆素的回收率偏高(129.3%),而香兰素、乙基香兰素和7-甲氧基香豆素的回收率偏低(均小于80%);但当使用乙醇时,9种香精成分的回收率均在90%～120%之间,可满足检测要求。故最终选择乙醇为最佳提取溶剂。

图 3 提取溶剂对9种香精成分回收率的影响(n=3)Fig. 3 Effect of extraction solvents on the recoveries of the nine flavor components (n=3)

2.3.3提取溶剂体积的选择

提取溶剂体积是影响化合物提取效率的一个重要因素,提取溶剂用量过少会造成提取不完全,而用量太多则浪费试剂。本研究以乙醇为提取溶剂,以回收率为指标,考察了不同提取体积(3、5、8、10、15和20 mL)对各目标物提取效率的影响。如图4所示,随着提取体积的增大,回收率逐渐增加,当提取体积大于10 mL时,回收率基本趋于稳定,为了确保最佳的提取效率,最终选择提取溶剂体积为15 mL。

图 4 提取溶剂体积对9种香精成分回收率的影响(n=3)Fig. 4 Effect of extraction solvent volumes on the recoveries of the nine flavor components (n=3)

2.4 基质效应(ME)的考察

基质效应是食品中微/痕量物质分析中影响定量结果的重要因素,因此需要判断样品是否有基质效应。本实验通过测定基质匹配标准曲线和纯溶剂标准曲线的斜率大小来考察基质效应。基质效应值根据公式(1)来计算:

ME=(1-Ss/Sm)×100%

(1)

其中,Ss是基质匹配标准曲线的斜率,Sm是纯溶剂标准曲线的斜率。当-50%50%时,说明该化合物的基质效应明显。实验结果表明,除了二氢香豆素、香豆素和甲基香兰素,其余6种化合物均表现出一定的基质效应。因此,为了减小基质效应对准确定量的影响,本实验采用基质匹配标准曲线对化合物定量分析。

2.5 方法学考察

2.5.1检出限、定量限和线性范围

分别配制一系列基质标准溶液,在优化好的气相色谱-三重四极杆质谱条件下测定方法的检出限、定量限和线性范围。以峰面积(Y)为纵坐标、各被测组分的质量浓度(X, μg/L)为横坐标作图,绘制基质标准曲线。结果表明，9种香精化合物在1～200 μg/L范围内呈良好的线性关系,其相关系数(R2)均大于0.997。在空白样品中分别添加系列浓度的混合标准溶液,进行前处理和测定,以3倍和10倍信噪比确定方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ)。如表3所示,各化合物的检出限和定量限分别为0.002～0.5 μg/kg和0.01～2 μg/kg,表明该方法可以满足基质复杂物质的痕量检测要求。

表 3 9种香精成分的线性范围、相关系数、检出限和定量限Table 3 Linear ranges, correlation coefficients (R2), limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of the nine flavor compounds

2.5.2回收率和精密度

取空白巴氏杀菌乳样品1 g,分别添加3个水平(1倍、2倍和4倍LOQ)的标准储备液,进行加标回收试验,每一水平做6次平行,并计算平均回收率和日内、日间精密度。9种化合物平均回收率为90.3%～110.6%,日内精密度为1.6%～7.9%,日间精密度为2.3%～9.3%(见表4)。

表 4 巴氏杀菌乳中9种香精成分的加标回收率、日内精密度和日间精密度(n=6)Table 4 Recoveries, intra-day precisions and inter-day precisions of the nine flavor compounds spiked in pasteurized milk (n=6)

2.5.3实际样品检测

针对市售的巴氏杀菌乳样品(10个),用本文建立的方法进行了检测分析。检测数据表明,7-甲氧基香豆素在其中的4个样品中检出,含量范围为0.01～2 μg/kg,其余8种化合物在实际样品中均未检出。

3 结论

本研究采用直接提取-低温高速离心净化结合GC-MS/MS,通过优选提取溶剂、提取溶剂体积和仪器参数,建立了快速定量测定巴氏杀菌乳中9种香精成分的分析方法。方法学评价和实际样品检测结果表明,该方法操作简便,灵敏度高,净化效果较好,可用于巴氏杀菌乳中多种香精的检测。